大肠癌围手术期气虚证与阴虚证患者基因差异表达图谱研究

洪朝金郭 勇（指导）

1浙江省人民医院肿瘤科 杭州 310014 2浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310006

·论 著·

大肠癌围手术期气虚证与阴虚证患者基因差异表达图谱研究

洪朝金1郭 勇2（指导）

1浙江省人民医院肿瘤科 杭州 310014 2浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310006

目的 研究大肠癌围手术期气虚证与阴虚证患者的特征性基因差异表达谱。方法 大肠癌手术患者8例，以围手术期中医辨证，气虚证4例（气虚证组），阴虚证4例（阴虚证组），采集8例患者大肠癌组织及瘤周正常组织，采用含有45 033个己知基因的人全基因组芯片技术检测大肠组织内差异基因表达情况，比较各组的差异表达基因，利用生物分子功能注释系统GO和pathway对相关基因进行生物信息学分析。结果 大肠癌围手术期气虚证瘤体组和瘤周正常组差异表达基因共5044条，表达水平上调3400条,下调1644条；气虚证瘤体组与阴虚证瘤体组差异表达基因共1335条，表达水平上调547条，下调788条。经检索互联网生物学公共数据库GeneBank，获得每条基因的名称和其他基本信息。结论 大肠癌围手术期气虚证组与瘤周正常组比较，存在的组织基因差异表达特征图谱，主要与细胞凋亡、细胞周期、血管平滑肌收缩、嘌呤嘧啶代谢、细胞信号传导、DNA复制等基因相关；气虚证组与阴虚证组瘤体比较，也存在组织基因差异表达特征图谱，主要是与炎症、免疫应答、矿物质吸收、细胞内吞、细胞黏附、遗传信息过程、肌动蛋白细胞骨架的调控、氮代谢、细胞信号传导等基因相关。

大肠癌围手术期；气虚证；阴虚证；基因差异表达；基因芯片

KEY WORDSperioperative period of colorectal carcinoma；Qi deficiency syndrome；Yin deficiency syndrome；genes differently expressed map gene chips

基因组学从整体上研究基因的功能，这与中医学的“整体观”概念十分相似。基因芯片是随着人类基因组研究的深入而迅速发展起来的一项重要的生物学技术，它的特点是高通量、快速、并行化采集生物信息。借助基因芯片这种先进、快速的研究手段，可以尝试从基因水平探讨大肠癌围手术期证候的本质，通过对同病异证基因表达谱差异比较中寻找证候的差异性，建立“证候-基因表达谱”，揭示证与基因的内在联系。证候研究是中医基础理论研究的核心内容。笔者对大肠癌围手术期气虚证与阴虚证患者的特征性基因差异表达谱进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIZOL试剂 （Invitrogen life technologies）；Invitrogen Superscript双链cDNA合成试剂盒（Invitrogen，11917-020）；NimbleGen单色DNA标记试剂盒；NimbleGen芯片杂交系统(Nimblegen，05223679001）；NimbleGen芯片杂交试剂盒（Nimblegen，05223474001）；NimbleGen HX12 mixer（Nimblegen，05223768001）；NimbleGen洗涤缓冲试剂盒（Nimblegen，05223504001）

1.2 仪器及设备 Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪（Corbett Research公司）；引物设计软件（Primer 5.0）；Rotor-gene 6.0（Corbett Research公 司）；GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）；GenePix 4000B（Axon）；GenePix pro V6.0。

1.3 病例来源 2011年8月—2011年10月共收集大肠癌围手术期患者8例，均来源于浙江大学附属第一医院。其中男4例，女4例，年龄48～68岁；结肠癌4例，直肠癌4例；术前均经肠镜明确诊断，术后病理证实；气虚证与阴虚证患者各4例。

1.4 诊断标准 大肠癌诊断标准参照中华人民共和国卫生部医政司《中国常见恶性肿瘤诊治规范》2011版。临床分期使用AJCC（2007年版）制定的TNM分期。中医辨证标准参照《GB/T 16751.2-1997中医临床诊疗术语证候部分国家标准（GB）》进行。气虚证:主证:①气短乏力；②神疲懒言；③舌淡；④脉虚细无力。次证：①头晕眼花；②饮食减少；③自汗。具备主证三项、次证一项者即为气虚证。阴虚证：主证：①五心烦热；②咽燥口干渴；③舌红或少苔、无苔；④脉细数。次证:①潮热；②便结而尿短赤；③盗汗。具备主证三项、次证一项者即为阴虚证。

1.5 纳入排除标准 纳入标准：①有细胞学或病理学依据；②大肠癌围手术期；③年龄50～70岁；④调查时能良好配合；⑤中医辨证气虚型或阴虚证。排除标准：①病理诊断不明确；②调查时合并有其他疾病，并以其他疾病为突出表现，影响大肠癌证候辨证者；③合并有严重的心、肺、脑、肝、肾、糖尿病等重大疾病者；④不符合纳入标准或临床资料不全者；⑤既往有恶性肿瘤史者；⑥精神病患者以及神志不清，无法语言交流者。

2 方 法

2.1 大肠癌组织采集 经肠镜下诊断符合纳入标准后，经手术室切取4例气虚证患者大肠癌组织及瘤旁正常组织各1块，4例阴虚证患者癌组织各1块。生理盐水清洗后，气虚证癌组织、瘤旁正常组织及阴虚证患者癌组织各取一块置于10%福尔马林液中备做病理切片HE染色检查，其余于置于RNAlater中，置冻存管中迅速投入液氮，以防止大肠癌组织内部的RNA降解。备基因芯片研究。

2.2 RNA提取和质量控制 采用Trizol及其方法抽提总RNA，12个组织样本RNA合并并混匀；采用NanoDrop ND-1000测定 RNA在分光光度计280nm、260nm、230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度，用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。样本的吸光度A260与A280比值在1.95～2.05之间，电泳RNA的28S和18S条带清晰，28S条带约是18S条带的2倍为质量合格。

2.3 荧光标记 以TotalRNA起始，严格按照Roche-NimbleGen试剂盒说明书进行，取反转录物，以Random Primer为引物进行Klenow酶标记，标记产物用PCR NucleoSpin Extract II Kit（MN）纯化。

2.4 杂交与清洗 将标记好的样品与杂交buffer（3×SSC，0.2%SDS，50×Denhart’s，25%甲酰胺）混匀后，注到已经与相应混合物黏合的芯片上，采用RocheNimbleGen Hybridization System杂交仪42℃杂交16～20h。杂交结束后，去除混合物，分别用洗液I、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ清洗芯片，甩干，扫描。

2.5 芯片扫描、图像的采集 采用GenePix4000B（Axon）扫描仪扫描芯片的荧光强度，观察杂交结果；采用Gene Pixpro V6.0软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号。

2.6 芯片数据分析 采用Agilent GeneSpring GX V11.5.1软件进行数据分析。对所有芯片的Normalized Intensity，Fold Change进行分析，取其Normalized Intensity做t检验，设定判断差异基因表达的标准为：Fold-Change＞2.0，P＜0.05为显著差异表达基因。使用安捷伦的Gene Spring GX软件（V11.5.1）进行分层聚类。对差异表达基因逐一进行生物信息学分析，检索互联网生物学公共数据库，如geneontology、GeneBank、KEGG等，进行GO和PATHWAY分析。

3 结 果

3.1 大肠癌组织病理学观察 病理切片HE染色检查，显示大肠癌围手术期气虚证患者瘤体组织出现癌细胞的浸润，瘤周正常组织无癌细胞侵及。见图1～3（封二）。

3.2 样本组织总RNA纯化及质检 280nm、260nm、

230nm下的吸光度分别代表核酸、蛋白、盐浓度的值。通常OD260/OD280（Ratio）应当接近2.0。在1.8～2.1时，认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的，OD/260/230（Ratio）应当大于1.8。经核酸定量分析仪检测，12例RNA的OD260/OD280在2.0左右，见表1，说明提取的RNA纯度较高。

表1 利用NanoDrop ND-1000检测RNA纯度和质量的结果

RNA质量判断标准：有清晰的28S、18S条带，无降解，且肉眼观察28S条带亮度约是18S的1～2倍。经琼脂糖凝胶电泳检测，由电泳图可见，RNA电泳条带清晰可见，无拖尾现象，28S比18S rRNA条带亮度接近2:1，质量合格，总量够用，满足后续实验需要。见图4。

图4 RNA琼脂糖凝胶电泳图

3.3 芯片扫描结果及分析 对第一组芯片如前所设条件进行分析，得出大肠癌围手术期气虚证瘤体组和瘤周正常组差异表达基因共5044条，其中，表达水平上调3400条，下调1644条。经检索互联网生物学公共数据库GeneBank，获得每条基因的名称和其他基本信息。主要为与细胞凋亡、细胞周期、谷胱甘肽新陈代谢、DNA修复、蛋白质生物合成、蛋白质运输、甾体生物合成，细胞信号传导等相关基因。对第二组芯片如前所设条件进行分析，得出大肠癌气虚证瘤体组和阴虚证瘤体组差异表达基因共1335条，其中，表达水平上调547条，下调788条。经检索互联网生物学公共数据库GeneBank，获得每条基因的名称和其他基本信息。主要为与炎症、免疫应答、矿物质吸收、细胞内吞、细胞黏附、遗传信息过程、肌动蛋白细胞骨架调控、氮代谢、细胞信号传导等相关基因。阴虚证与气虚证所涉及炎症相关主要差异基因表达上调的有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，FZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。涉及细胞内吞作用（Endocytosis）主要差异基因表达上调的有：DNM1，EPN1，F2R，GRK6，IGF1R，IL-2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

4 讨论

本研究结果显示，气虚证与阴虚证差异表达基因主要涉及以下几类：炎症，细胞内吞，矿物质吸收，酮体合成与分解，免疫功能，信号传导通路等。

炎症是机体对致炎因子的损伤所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。此过程主要表现为局部组织发生变质（变性、坏死）、渗出（血管反应、液体和细胞渗出）和增生改变，临床上有红、肿、热、痛和功能障碍，而全身则常伴有不同程度的发热、白细胞增多、代谢增强等。局部发生的一系列变化，有利于局限、消灭致炎因子和清除坏死组织，促进局部修复，对机体是有利的。但是，并不是所有炎症对机体都是有利的，有时也会给机体带来危害。本研究中气虚证与阴虚证涉及相关主要差异基因表达上调的有16条：炎症主要差异表达基因有：TNF-α，IL-1Ra，IL-2RG，NFYATF2，BCL2L1，DVL3，ELK1，ELK4，FZD4，JAK3，NFATC1，NFB，RELA，RELB，SLC2A1，WNT5A等。

肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）主要由活化单核巨噬细胞产生，又称恶液质素，活化T淋巴细胞也可产生一种与TNF-α类似的（有30%左右的同源性）淋巴毒素，并与TNF-α有共同的受体，称之为TNF-β。TNF-α基因位于第6号染色体短臂的主要组织相容性复合体（MHC）内，与TNF-β基因紧密连锁，存在于C2与HLA-B基因之间。人的TNF-α根据种属及分离方法不同，可以二聚体、三聚体和五聚体的形式存在。人的TNF-α为非糖基化蛋白，而几乎所有动物的TNF-α均为糖蛋白。小鼠和人的TNF-α分别由其前体分子在N端脱去76和79个氨基酸而成[1]。

肿瘤坏死因子是一种具有多种生物功能的促炎细胞因子。它可以活化内皮细胞促进黏附分子的表达，参与炎症细胞的募集，还可以通过调节其它炎症因子的表达从而影响炎症反应的程度[2]。

IL-1Ra也是一类重要的抗炎性细胞因子。研究发现，IL-1Ra可以抑制IL-l与IL-1R结合，起到抗炎症作用。IL-1Ra能抑制PGE生成，下调Cox-2和胶原酶-1的表达，减轻白细胞浸润[3]。IL-1Ra可以抑制脂多糖（LPS）刺激的单核巨噬细胞释放TNF-1α和IL-lβ[4]，IL-1Ra能够与IL-1R结合，但不能启动相应的信号转导。且IL-1Ra可以与IL-l竞争结合IL-1R，从而阻断IL-lα/β介导的信号转导，降低IL-1的生物学活性[5]。申维玺等[6-9]运用分子生物学的理论和方法进行研究，提出了阴虚证的本质可能是白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子表达发生改变；阴虚证的基本发病学机制是由于机体在各种致阴虚证病因的损害作用下，IL-1、TNF等炎性细胞因子群的基因表达水平相对增强、生物学活性相对升高，引起细胞因子网络紊乱和功能态平衡失调的结果。阴虚证时，机体免疫力降低，IL-1Ra基因表达下调，IL-1Ra产生减少，不能有效抑制IL-1与IL-1R结合，导致阴虚证时炎性细胞因子IL-1等的活性增强。

阴虚证与气虚证涉及细胞内吞作用（endocytosis）主要差异基因表达上调的有10条：DNM1，EPN1， F2R，GRK6，IGF1R，IL2RG，NEDD4，PIP5K1A，PML，SMAD6。

细胞通过胞吐作用将细胞内的物质运送到细胞外，又通过内吞作用将细胞外的营养物质等摄取到细胞内以维持正常的代谢活动。细胞的内吞有两种类型，一种是吞噬细胞完成的对有害物质的吞噬，另一种类型是通过细胞质膜受体介导的对细胞外营养物质的内吞。赖梅生等[10]利用具有养阴功效的滋阴清热方治疗SLE阴虚证，治疗前高表达的基因IL-2R，治疗后明显下降，提示IL-2R基因高表达可能与阴虚证相关，滋养清热方作用机制可能是通过影响IL-2R表达，进而影响细胞的内吞作用。

本研究亦显示，与气虚证相比，阴虚证中与细胞内吞作用的相关基因IL-2等表达明显增加，提示气虚证与阴虚证可能在有关影响细胞内吞作用的基因中存在差异。

本研究结果提示，大肠癌围手术期气虚证与阴虚证存在有组织差异表达基因组学背景，发现的一批大肠癌围手术期气虚证瘤体组与阴虚证瘤体组差异基因，可以进一步从功能基因组学的角度对其调控网络进行分析和蛋白表达等方面进行深入研究，并进而推广至其他主要证候，寻找新型证候标志物，从而作为大肠癌中医辨证论治的实验依据，并为建立科学评价大肠癌的中医药疗效指标奠定基础。可以从不同证候基因表达谱的差异，探寻“证”的基因表达谱，进一步研究出“证”的基因芯片；同时，建立不同“证”的基因芯片，将中医的“证”制成具有基因表达水平定性和定量作用的表达谱芯片，使诊断趋向规范化；使辨证结论达到最佳化，确立治则和选方用药个体化，从而实现中医证的临床诊断治疗的现代化。

［1］谢丛华.肿瘤坏死因子的多重临床意义［J］.国外医学内科学分册，2005，32（6）：247-250.

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Comparison of Differently Expressed Genes Between Patients with Qi Deficiency and Yin Deficiency in Perioper-ative Period of Colorectal Carcinoma

HONG Chaojin1,GUO yong2(advisor).1.Department of Oncology,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou(310014),China;2.First Clinical Medicine School of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective Comparison of differently expressed genes between patients with Qi deficiency and Yin deficiency in perioperative period of colorectal carcinoma.Methods Eight patients with colon carcinoma undergone colectomy were divided into two groups according to the differential diagnosis with TCM syndrome during the perioperative period:Qi deficiency group（n=4）and Yin deficiency group（n=4）.The tumor tissue and corresponding non-tumor normal tissues were collected for detection of gene expression by human gene technology with 45 033 known human genes.The gene chip images of two groups were analyzed by Pathway and GO system.Results A total of 5044 genes expressed differently in colorectal tissue and corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,among which 3400 were up-regulated and 1644 were down-regulated;the expression of 1335 genes were different between Qi deficiency group and Yin deficiency group,among which the expression was elevated in 547 genes and was decreased in 788 genes.After retrieving the public databank,the names and basic information of all these differently expressed genes were obtained.Conclusion Comparing tumor tissue with corresponding non-tumor normal tissue in Qi deficiency group,the differently expressed gene map included apoptosis,cell cycle, vascular smooth muscle contraction,purine and pyrimidine metabolism,signaling pathway,and DNA replication.The difference in gene expression between Qi deficiency and Yin deficiency group included inflammation,immune response,mineral absorption,endocytosis,cell adhesion,genetic information pathway,regulation of actin cytoskeleton, nitrogen metabolism,signaling pathway.

2014-05-28

修回日期：2014-07-14

浙江省中医药科技计划重大项目（No.2007ZA007）

郭勇，Tel：13588887292