过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

潘姝花，郑婷婷，郑旭升，吴登伟，陈培远，许传莲

（浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

潘姝花，郑婷婷，郑旭升，吴登伟，陈培远，许传莲

（浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

Akt1是细胞信号传导通路中的关键信号分子，具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭，以及抑制细胞凋亡，抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJM1-Akt1重组质粒，利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞，用嘌呤霉素筛选得到Akt1稳定过表达的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株，通过Western bloting分析细胞株中Akt1的表达情况。结果显示：Bel-7404/Akt1与K562/Akt1细胞中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞，成功构建过表达Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1稳转细胞株。Akt1过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及逆转细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的研究提供了实验模型。

Akt1；重组质粒；病毒侵染

0 引 言

Akt是一种处于PI3K/Akt信号转导通路（又称Akt或PKB通路）核心部位的丝氨酸/苏氨酸激酶，存在由不同的基因编码的Aktl/PKBα、Akt2/ PKBβ、Akt3/PKBγ3种亚型，具有促进细胞增殖、生长、抑制细胞凋亡等作用。另外，Akt在促进细胞迁移、侵袭，以及促进血管生成，抵抗化疗和放疗等方面也起着重要作用［1-2］。Akt是存在于人类染色体中的鼠类胸腺瘤病毒（t-8 strain from AKR/J mouse，Akt8）致癌基因的同源物，已被定义为癌基因［3-4］，在多种肿瘤中均存在异常表达和活化现象，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌等［5-7］。目前，国内外关于PI3K/Akt信号通路与药物耐药性关系的研究越来越多，并且该通路被认为是化疗耐药治疗的新靶点［2］。许多研究表明化疗药物可增加Akt活化水平，使肿瘤细胞产生药物化疗耐受，深入研究Akt作用机制，可为肿瘤基因治疗、抗肿瘤药物开发提供新靶点［8-9］。

本研究选用p LJM1慢病毒载体，构建重组质粒p LJM1-Akt1，并运用病毒侵染的方法筛选得到Akt1稳定高表达K562与Bel-7404细胞株。本研究旨在运用慢病毒载体的优势构建Akt1高表达细胞株，为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及MDR的研究提供实验模型，并为后续深入研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

DNA限制性内切酶Age I和Eco R I购自Takara公司；反转录试剂盒购自TOYOBO公司；Akt1抗体购自Cell Signaling公司；Akt1引物由上海英骏生物技术有限公司合成。慢病毒载体p LJM1、包装载体（psPAX2、pMD2.G）和大肠杆菌菌株Stbl 3由浙江理工大学新元医学与生物技术研究所保存。

1.2 细胞株

人肾上皮细胞293T、人肝癌细胞Bel-7404、人慢性髓性白血病细胞K562均为浙江理工大学新元医学生物技术研究所保存。

1.3 重组载体构建

提取Bel-7404细胞的总RNA，逆转录得到cD-NA模板，以Akt1上游引物（Former primer，FP）：5′-CGCACCGGTATGAGCGACGTGGCTATTGTGAA-3′；下游引物（Reverse primer，RP）：5′-CCGGAATTCTCAGGCCGTGCCGCTGG-3′扩增Akt1片段。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；98℃变性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，反应为30个循环；继续68℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收。Akt1目的片段和p LJM1载体均用限制性内切酶Age I和Eco R I在37℃同时酶切2.5 h。将酶切回收的Akt1基因产物与载体p LJM1片段用T4连接酶进行连接，置于16℃水浴中连接过夜，得到重组质粒p LJM1-Akt1，并经质粒PCR、双酶切及测序鉴定。

1.4 慢病毒包装

取7.5×105/dish 293T细胞接种至直径10 cm的培养皿中培养，待细胞汇合度达50%左右，换成6 mL无血清MFM培养基培养3 h；取10μg p LJM1-Akt1（或p LJM1），3.5μg p MD2.G，5.5μg psPAX2至400μL无血清MFM培养基中；取另一FP管中加入20μL Transfers至400μL无血清MFM培养基中，室温孵育5 min。混合两FP管培养基轻轻吹打混合均匀，室温孵育20 min，逐滴加入细胞培养皿中。细胞于37℃培养箱中培养6 h后换成10%血清的DMFM培养基培养；培养24 h后，观察293T细胞，约有30%左右的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产生）。继续加入6 mL 10%血清的DMFM培养基培养，48 h后再收获一次病毒。将两次收获的病毒液合并，可用孔径为0.45μm的针头滤器过滤去除293T细胞，取滤液感染K562、Bel-7404细胞。

1.5 病毒包装成功与否鉴定

收集转染48 h后的293T细胞，加入细胞裂解液收集蛋白，通过Western blot检测是否成功包装p LJM1-Akt1慢病毒。

1.6 慢病毒感染及稳定株的筛选

K562细胞、Bel-7404细胞在感染前2 h分别换新鲜的含10%FBS的RPMI-1640、DMFM培养基6 mL，滴加4 mL病毒液感染细胞；并于12 h后第二次感染细胞。24 h后换含5%FBS的RPMI-1640和DMFM培养，感染两天后用0.6μg/mL的嘌呤霉素（puromycin）进行筛选。以未感染的K562细胞、Bel-7404细胞作为对照，每隔两天换一次选择性培养基，最优浓度为在3～5 d内杀死所有对照组细胞的浓度。细胞传代后继续用0.6μg/mL的puromycin进行筛选。

1.7 稳转细胞株验证

细胞筛选5～6次后，收集K562细胞、Bel-7404细胞及其未感染对照K562细胞、Bel-7404细胞，进行Western blot检测目的蛋白Akt1的表达情况。

2 结果与分析

2.1 目的产物扩增

提取的RNA进行逆转录成cDNA，以逆转录产物cDNA为模板进行PCR反应。Akt1 PCR扩增产物如图1，片段大小在1 400 bp左右，与目的片段Akt1相符。

图1 目的片段Akt1 PCR扩增产物

2.2 重组质粒p LJM1-Akt1的PCR鉴定

目的片段Akt1和载体pLJM1双酶切后，经T4连接酶连接后，在无抗性的LB液体培养基中活化后，涂布至含有Amp抗性的LB固体培养基平板上，经12 h左右挑取单克隆扩大培养，并提取质粒做质粒PCR鉴定，图2的鉴定结果显示，存在阳性克隆且片段大小在1400 bp左右，与预期目的片段Akt1相符。

图2 重组质粒p LJM1-Akt1的PCR鉴定

2.3 重组质粒p LJM1-Akt1的酶切鉴定结果

重组p LJM1-Akt1质粒提取后，进行单/双酶切鉴定，结果显示重组质粒经Eco R I酶切后得到单一条带，经Age I和Eco R I双酶切后得到两条条带，且与目的片段Akt1大小（1 443 bp左右）以及p LJM1质粒大小（8 083 bp）相符，具体结果见图3。

图3 重组质粒pLJM1-Akt1的单双酶切鉴定图

2.4 测序鉴定结果

测序结果显示，构建的重组质粒目的片段Akt1的碱基序列正确。

2.5 p LJM1-Akt1与包装质粒共转染293T细胞

载体p LJM1带有FGFP荧光蛋白的标签，能产生绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下能看到大量绿色荧光，转染效率达50%以上，结果见图4所示。

图4 pLJM1质粒转染293T的荧光显微镜观察（100×）

2.6 包装的慢病毒Western blot检测

收集转染48 h后的293T细胞，加入细胞裂解液收集蛋白，通过Western blot检测是否包装成功p LJM1-Akt1慢病毒。结果如图5所示，293T/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型293T/WT细胞，说明p LJM1-Akt1慢病毒包装成功。

图5 293T/Akt1和293T/WT细胞中的Akt1表达量

2.7 稳转细胞株的验证

经筛选得到稳定的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株后，收取Bel-7404/Akt1、Bel-7404细胞、K562/Akt1细胞和K562细胞，进行Western blot检测目的蛋白Akt1的表达，结果见图6。图6可见，Bel-7404/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞，K562/Akt1细胞株中Akt1表达量明显高于野生型K562细胞。

图6 Bel-7404/Akt1、Bel-7404/WT和K562/Akt1、K562/WT细胞中的Akt1表达量

3 讨 论

Akt激酶是PI3K/Akt通路中关键信号分子，在促进细胞增殖、生长，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移、侵袭，促进血管生成，抵抗化疗和放疗等方面具有重要作用，在多种癌细胞中异常表达［1-2］。

有研究发现在胃癌AGS细胞中上调PI3K/ Akt的表达可导致P-gp相关及不相关药物耐药［10］。Simon等［11］报道抑制Akt的活力可以促进多药耐药胃癌细胞凋亡、逆转耐药及增强胰腺癌耐药株对吉西他滨的敏感性。Yuan等［12］发现过度活化的Akt可以通过抑制凋亡信号激酶（ASK）并且抑制ASK下游JNK和P38的活性，从而产生耐药性。Jin等［13］发现乳腺癌细胞株MCF对紫杉醇、5-Fu以及阿霉素的耐药与PI3K/Akt的活性升高有关，而抑制PI3K/Akt可以逆转MCF7的耐药性。这些结果均表明，Akt与肿瘤细胞耐药密切相关。

Aktl是Akt家族成员之一，不但影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，而且对许多肿瘤的侵袭和转移也有影响。磷酸化的Aktl可以促进纤维肉瘤细胞、成纤维细胞、人类胰腺癌细胞等多种癌细胞的侵袭能力［14-16］。有研究发现在乳腺癌细胞中发现Akt1异常表达，并且在癌细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用［17］。Aktl在喉癌组织中也异常表达，且与其病理分化程度和喉癌发生发展密切相关［18］。另有研究发现通过RNA干扰Aktl基因沉默具有抑制喉癌细胞增殖，促进细胞凋亡等作用，因此，Aktl可作为喉癌基因治疗的候选新靶点［19］。这些结果均表明，Aktl在不同的肿瘤细胞中发挥着重要作用。

深入研究PI3K/Akt通路在多药耐药中的具体机制可能为肿瘤治疗提供一个新的靶点。本研究用慢病毒感染的方法，筛选得到Akt1高表达细胞株Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞，为寻找和筛选更加高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂和逆转多药耐药癌细胞凋亡的后续研究提供研究模型。

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EstabIishment and Identification of Over Expression of Akt1 CeII Strain

PAN Shu-hua，ZHENG Ting-ting，ZHENG Xu-sheng，WU Deng-wei，CHEN Pei-yuan，XU Chuan-Lian
（College of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Akt1 is a key signal molecule in cell signal transduction pathways，which promotes cell growth，proliferation，migration and invasion，inhibits cell apoptosis and resists chemotherapy and radiotherapy.This study establishes the p LJM1-Akt1 recombinant plasmids and transfects the recombinant plasmids into K562 and Bel-7404 cells with the method of virus infection.We obtained stable Bel-7404/ Akt1 and K562/Akt1 over expressed by Akt1 through puromycin screening.Akt1 expression in the cell strain was analyzed through Western bloting.The results show that the expression quantity of Akt1 in K562/Akt1 and Bel-7404/Akt1 cells is significantly more than that in wild K562 and Bel-7404 cells；stable and transfected cell strains of K562/Akt1 and Bel-7404/Akt1 of over expressed Akt1 are successfully established.The successful establishment of over expressed Akt1 cell strain provides experimental model for seeking and screening efficient，low-toxicity，strong-specificity Akt1 inhibitors and studying reverse multidrug resistance（MDR）.

Akt1；recombinant plasmid；virus infection

Q786

A

（责任编辑：许惠儿）

1673-3851（2014）04-0462-05

2013-12-04

潘姝花（1988-），女，浙江富阳人，硕士研究生，主要从事天然产物方面的研究。

许传莲，F-mail：chuanlianxu@163.com