响应面法优化重组枯草芽孢杆菌生产纤维素酶EGA的研究

陈 涛，张漫莉，李晶虹，吴程雨，赵辅昆，陈 玮

（浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌生产纤维素酶EGA的研究

陈 涛，张漫莉，李晶虹，吴程雨，赵辅昆，陈 玮

（浙江理工大学生命科学学院，杭州310018）

通过响应面优化法（response surface methodology，RSM）对分泌表达纤维素酶FGA重组枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化。利用Plackett-Burman实验设计对淀粉、酵母粉、蛋白胨等8个因素对枯草芽孢杆菌产纤维素酶FGA的显著影响与否进行评估分析，筛选得到淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O为3个显著影响的因素，再利用Box-Behnken实验设计对这3个因素进行进一步优化，确定最佳培养基的配比为淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，蛋白胨25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/ L。在最优条件下，利用小型发酵罐对重组菌进行扩大培养，其最高酶活力达到1 264 U/L。

纤维素酶FGA；枯草芽孢杆菌；响应面优化；发酵

0 引 言

纤维素是由β-1′4-糖苷键连接的多聚葡萄糖，广泛地分布于自然界中，如秸秆稻草、木材及各类废弃纸张等都是纤维素的丰富来源。同时，纤维素又是自然界中分布最为广泛的可再生资源，通过光合作用每年可产生超过100亿t纤维素物质贮存于植物干物质内。然而，这巨大的资源宝库还未被有效开发与利用。通过生物降解的方法能有效地将纤维素物质转化成简单糖，进而再发酵生产醇类物质，可作为一种洁净的可再生资源［1-4］。

纤维素的生物降解体系包含了各种组分的纤维素酶（cellulase）［5-6］，其中最主要的为内切β-1，4-葡聚糖酶（endo-1，4-β-glucanase，FC3.2.l.4）、外切β-1，4-葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucannase，FC3.2.1.91）和β-1，4-糖苷酶（β-1，4-glucosidase，FC3.2.1.21）。通过各种酶的协同作用可将纤维素酶彻底降解成单糖。因此，纤维素酶的获取是有效利用纤维素的关键之一。

纤维素酶FGA是由福寿螺胃液中分离出的共生菌株BaciLLus sp.Strain AC-1所产的一种纤维素内切酶。该酶具有较好的热稳定性且在酸性条件下相对稳定，有较好的工业应用前景［7］。在前期工作中，利用了枯草芽孢杆菌［8］对其进行了重组表达，在此基础上，本文利用相应面法［9-10］对已构建的重组菌株的发酵产酶条件进行了进一步优化，并进行了小规模发酵放大实验，为大规模生产纤维素酶FGA提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重组枯草芽孢杆菌p AUsp-ega/WB700，由本实验室构建保存。

1.1.2 试剂

酵母粉、蛋白胨购自OXOID公司，羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自Sigma公司，其余试剂均为国产试剂。

1.1.3 培养基

LB培养基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L。

枯草芽孢杆菌基础表达培养基：蛋白胨20 g/ L，酵母粉10 g/L，可溶性淀粉20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl20.1 g/L，NaCl 5 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养操作

将低温保存的p AUsp-ega/WB700甘油菌在的LB培养基固体平板上进行划板培养12 h。挑取单个菌落接种至含3 m L的LB培养基的试管中，在37℃，200 r/min摇床中培养8～12 h，以1∶100的比例转接至含50 m L LB培养基的锥形瓶中，置于37℃，200 r/min摇床培养摇床培养24 h。收集发酵液于4℃，5 000 r/min离心5 min收集上清液，测定纤维素FGA酶活力。为保持菌株质粒稳定性，各级培养基中均含有终浓度为50μg/m L硫酸卡纳霉素（Kanamycin）。

1.2.2 发酵罐培养操作

将筛选出的p AUsp-ega/WB700单克隆菌株先接种至含的3 mL的LB试管中，在37℃，200 r/min的摇床培养8～12 h；再按1∶100的比例接种至含50 mL LB培养基的锥形瓶中，在37℃，200 r/min培养12 h后转接至含5 L优化培养基的发酵罐中进行发酵培养，在培养温度为37℃，p H为7.0，转速800 r/min，通气量为10 L/min的稳定条件进行发酵培养，并间隔一定时间提取适量发酵液，离心取上清液测定酶活力。

1.2.3 纤维素酶FGA酶活力测定

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）检测法［11］：先将羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶于20 mM的p H 6.5的磷酸钠缓冲液中，配成1%（w/v）的溶液；取180μL 1%的CMC-Na于65℃条件下预热5 min；加入20 μL纤维素酶FGA酶液，在65℃进行酶活反应10 min；然后加入500μL DNS试剂煮沸5 min终止反应；迅速冷却并加入500μL dd H2O；利用分光光度计检测520 nm吸光值。以灭活的酶液进行空白对照。

酶活力定义：在羧甲基纤维素钠（CMC-Na）检测法中定义一个酶活力单位为1 min水解产生1μmol还原糖所需的酶量。

1.2.4 Plackett-Burman实验

根据前期单因素实验结果对包含空白在内的共9个因素分别选取高水平（用“1”表示）和低水平（用“-1”表示）进行的Plackett-Burman实验设计，各因素值见表1。

表1 PIackett-Burman实验设计

1.2.5 Box-Behnken实验

在Plackett-Burman实验设计的基础上，对其中显著影响产酶活力的因素重新编号，分别选取3个水平（高水平用“1”表示，中水平用“0”表示，低水平用“-1”表示）进行Box-Behnken实验设计分析，详细取值见表2。

表2 Box-Behnken实验设计

2 结 果

2.1 Plackett-Burman实验设计结果

按表1的取值进行Plackett-Burman实验结果见表3。

表3 PIackett-Burman实验结果

表3的结果通过Design Fxpert 7.0软件对数据进行分析。当P值小于0.05时，该因素为显著影响因素，由分析结果可知，A、B、H为3个显著影响因素。R2（调整）为96.21%，表示此模型可以解释96.21%的以上实验结果，且可靠。

2.2 Box-Behnken实验设计结果

Box-Behnken实验数据结合软件分析的结果见表4和表5，所选取的3个因素中各因素的交互作用见图1-3图。

等高线图越接近椭圆，说明这两个因素之间的交互作用显著，反之，若等高线图接近圆形则说明这两个因素之间的交互作用不显著。由图1-图3的响应面和等高线图可以直观地反映出各因素之间的交互作用，其中，淀粉和酵母粉之间的交互作用最显著。而图1-图3的响应面立体显示的顶点即为产酶量的最大值，该顶点的坐标值则为对应最大产酶时各因素的取值，分别是A=0.2，B=0.08，C= 0.03，对应浓度为可溶性淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，获得最优产产酶量为1 052 U/L。

表4 Box-Behnken实验数据

表5 Box-Behnken实验数据软件分析结果

图1 淀粉和酵母粉影响产酶量的响应和等高线

图2 淀粉和MgSO4·7H2O影响产酶量的响应和等高线

图3 酵母粉和MgSO4·7H2O影响产酶量的响应和等高线

2.3 发酵实验

在响应面优化的基础上采用小型发酵罐对重组菌进行扩大培养。控制温度为37℃、利用稀HCl和NaOH控制发酵过程p H为7，恒定转速为800 r/ min，通气量为10 L/min。取不同时间点检测发酵液菌体密度和上清酶活力其结果如图4示。

图4 发酵时间与菌体生长密度和纤维素酶FGA产酶活力的关系曲线

菌体的生长在8 h内呈现对数增长的趋势，同时纤维素酶活力快速增长；发酵至8 h时达到最大产酶量1 264 U/L。之后，菌体生长逐渐进入平台期，发酵体系中蛋白水解酶的逐渐积累，纤维素酶FGA被降解，酶活力持续降低。

3 结 论

纤维素酶作为一种高效的生物催化剂，其应用主要集中在饮料业，发酵、酿造工业，饲料工业和医药行业中，除此之外，纤维素酶在糖化发酵生产燃料乙醇的领域也有重要的应用。本文通过响应面优化法对重组枯草芽孢杆菌pAUsp-ega/WB700产纤维素酶FGA进行发酵培养基配比进行优化，通过Plackett-Burman实验设计，从各培养基组分中筛选出著影响因素为淀粉、酵母粉和MgSO4·7H2O。并对这3个因素进一步使用Box-Behnken实验设计方案，结合软件分析，确定摇瓶培养的最优产酶时各因素的取值分别为淀粉21 g/L，酵母粉11.26 g/L，蛋白胨25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.005 g/L。在此基础上，采取发酵罐扩大培养，相比普通的摇瓶实验只能控制体系的温度和转速，发酵实验过程中还可以精准的控制体系的p H、溶氧量和营养成份，发酵产纤维素酶FGA的最高酶活力可达1264 U/L，相比原始菌种的产酶活力提高了6倍［12］，对提高纤维素酶表达量，广泛应用于工业化生产具有重要的意义。

参考文献：

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［5］Zhang Y H P，Lynd L R.Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose：Noncomplexed cellulase systems［J］.Biotechnology and Bioengineering，2004，88（7）：797-824.

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［7］Irshad M N，Anwar Z，But H I，et al.The industrial applicability of purified cellulase complex indigenously produced by trichoderma viride through solid-state bioprocessing of agro-industrial and municipal paper wastes［J］.BioResources，2012，8（1）：145-157.

［8］李 明，双 宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用［J］.东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

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［10］Trupkin S，Levin L，Forchiassin F，et al.Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2003，30（12）：682-690.

［11］张漫莉，耿新伟，王梦婷，等.纤维素酶FGA基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其产物性质研究［J］.浙江理工大学学报，2013，30（3）：389-393.

［12］Li Y H，Ding M，Wang J，et al.A novel thermoacidophilic endoglucanase，ba-ega，from a new cellulose-degrading bacterium，baciLLus sp.Ac-1［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：430-436.

Research on CeIIuIase EGA Production through Optimization and Recombination of BaciIIus SubtiIis Based on Response Surface MethodoIogy

CHEN Tao，ZHANG Man-Li，LI Jing-hong，WU Cheng-yu，ZHAO Fu-kun，CHEN Wei
（School of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Response Surface Methodology was used to optimize the fermentation conditions for secretory expression cellulose FGA and recombination of bacillus subtilis.Plackett-Burman experimental design was adopted to evaluate and analyze obvious effects of 8 factors（including starch，yeast powder and peptone）on producing cellulase FGA by bacillus subtilis.3 factors with obvious effects were screened out：starch，yeast powder and MgSO4·7H2O.Then，Box-Behnken experimental design was used to further optimize the 3 factors.Finally，the ratio of optimal culture medium was confirmed as follows：starch 21 g/ L，culture medium11.26 g/L，peptone 25 g/L，MgSO4·7H2O 1.52 g/L，KH2PO40.395 g/L，NaCl 3.25 g/L，CaCl20.1 g/L and FeSO4·7H2O 0.005 g/L.Under the optimal conditions，a small fermentation tank was used to enlarge cultivation of recombinant bacteria.The highest enzyme activity reached 1 264 U/L.

cellulase FGA；bacillus subtilis；response surface methodology；fermentation

Q786

A

（责任编辑：许惠儿）

1673-3851（2014）04-0451-05

2013-12-27

浙江省大学生科技创新项目（2013R406021）

陈 涛（1988-），男，浙江湖州人，硕士研究生，主要从事分子生物学和微生物发酵的研究。

陈 玮，电子邮箱：cw@zstu.edu.cn