HPLC梯度洗脱法同时测定鼻炎喷剂中3种组分的含量

吕冠欣，龚越强，严静，欧景仪（.佛山市顺德区药品检验所，广东 佛山 58300；.佛山市顺德区桂州医院，广东 佛山 58300）

鼻炎喷剂是佛山市顺德区桂州医院研发的一种医院制剂（批准文号:粤HB20111414），处方含盐酸麻黄碱、环丙沙星、醋酸泼尼松龙等，具有抗菌、消炎、收缩血管的作用，临床主要用于治疗急慢性鼻炎、鼻黏膜肿胀等。该制剂目前的质量标准只对处方中环丙沙星进行了含量测定；笔者查阅了相关资料[1-6]，大部分资料只记载该制剂中1种成分的含量测定方法，并无3种组分同时测定的方法。为了提高制剂的质量标准，保障用药安全、有效，本研究参考了类似的多组分同时测定的相关文献[7-9]，建立了同时测定鼻炎喷剂中盐酸麻黄碱、环丙沙星、醋酸泼尼松龙的高效液相色谱（HPLC）法，经方法学验证，该方法快速、灵敏、准确、可靠，能更好地控制本品质量。

1 材料

1.1 仪器

1260 HPLC仪、G4212B二极管阵列检测器、EZChrom色谱工作站（美国Agilent公司）；AG135型电子分析天平（德国梅特勒公司）。

1.2 药品与试剂

盐酸麻黄碱对照品（批号:171241-201007，供含量测定用，纯度:99.7%）、环丙沙星对照品（批号:130451-200302，供含量测定用，纯度:84.9%）、醋酸泼尼松龙（批号:100012-200706，供含量测定用，纯度:99.7%）均来源于中国食品药品检定研究院；鼻炎喷剂（顺德区桂州医院，批号:130601、130602、130605，规格:每瓶15 ml，每1 ml中含盐酸麻黄碱、环丙沙星、醋酸泼尼松龙分别为10、5、0.5 mg）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:SHIMADZU Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）；流动相A:甲醇，B:乙腈，C:0.05 mol/L磷酸二氢钾（含0.25%三乙胺，磷酸调节pH 3.0），梯度洗脱；流速:1.0 ml/min；随梯度改变紫外检测波长分别为207、278、247 nm；柱温:40℃；进样量:10 μl。理论板数按盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙计分别为5995、7208、13382，拖尾因子分别为1.07、1.13、1.03，色谱峰与其他峰分离度不低于2.0。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品盐酸麻黄碱100.23 mg、环丙沙星109.25 mg、醋酸泼尼松龙10.81 mg，分别置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度分别为0.9993、0.9275、0.1078 mg/ml的对照品贮备液。分别精密量取上述贮备液10、5、5 ml置于25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取鼻炎喷剂1 ml，置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备

按处方量取辅料，制备不含盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙的阴性样品（空白基质），按“2.3”项下方法操作制得阴性样品溶液。

2.5 干扰试验

取上述3种溶液进样，结果在供试品溶液色谱图中，在对照品色谱峰相应的位置上无吸收峰，表明空白基质中各成分对测定结果未见影响，见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.盐酸麻黄碱；2.环丙沙星；3.醋酸泼尼松龙Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative sample；1.ephedrine hydrochloride；2.ciprofloxacin；3.prednisolone acetate

2.6 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下对照品贮备液适量，配制成一系列不同质量浓度的标准溶液，含盐酸麻黄碱为99.93、199.86、399.72、599.58、799.44 μg/ml，环丙沙星为46.38、92.75、185.50、278.25、371.00 μg/ml，醋酸泼尼松龙为 5.39、10.78、21.56、32.34、43.12 μg/ml，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（A）对质量浓度（c）进行线性回归，得回归方程，结果见表2。

表2 3种组分的线性关系（n＝5）Tab 2 Linear ranges of 3 componments（n＝5）

2.7 精密度试验

取同一批号（130601）的供试品溶液1份，连续进样6次，结果盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙峰面积的RSD分别为0.8%、0.8%和0.7%（n＝6），表明该方法精密度良好。

2.8 稳定性试验

取同一批号（130601）的供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、12 h进样测定，结果盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙含量的RSD分别为0.3%、0.6%和0.8%（n＝6），表明供试品在12 h内稳定。

2.9 重复性试验

取同一批号（130601）样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙含量的RSD分别为0.9%、1.0%和1.3%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.10 回收率试验

分别精密量取盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙对照品适量，加入处方比例的阴性基质，各配制3种组分分别相当于处方量80%、100%、120%的样品各3份，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 回收率试验结果（n＝3）Tab 3 Results of recovery test（n＝3）

2.11 样品含量测定

取3批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再分别精密量取供试品溶液和混合对照品溶液注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3）Tab 4 Content determination of samples（n＝3）

3 讨论

（1）将对照品溶液注入色谱仪，以二极管阵列检测器在190～400 nm波长处记录色谱图，高效液相三维图显示，盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙的最大吸收波长分别在207、278、247 nm，因此采用改变检测波长的方法，使待测物质能得到最灵敏的结果。而且，在本研究的色谱条件下，盐酸麻黄碱、环丙沙星和醋酸泼尼松龙的保留时间分别约为5、18、44 min，各峰出现间隔时间较长，能有足够的时间使改变检测波长后的图谱稳定、基线漂移不明显，因而不会影响分析结果。

（2）经前期试验发现，流动相中水相的pH对组分的峰形有较大影响:pH过高，环丙沙星峰会产生前沿现象；pH过低，盐酸麻黄碱峰会产生拖尾现象。经参阅相关资料[10]，最终确定pH为3.0±0.1，结果较为理想。

（3）该制剂原标准中只有环丙沙星的含量测定，处方中盐酸麻黄碱为限用物质，应有含量标准的规定。因此，笔者建立了同时测定处方中3种组分的含量测定方法，结果表明该方法操作简便、灵敏度高、分离良好。故本方法可为鼻炎喷剂的生产质量控制提供科学的分析方法，从而完善该制剂的质量控制指标。

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