RP-HPLC法测定康普瑞丁A4磷酸酯聚合物囊泡的含量

朱金芳，胡梦莹，邱利焱#（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 83005；.浙江大学药学院，杭州 310058）

从南非灌木Combretum caffrum中分离得到的康普瑞丁A4（CA4）是一种作用于秋水仙碱位点的微管蛋白结合剂，康普瑞丁A4磷酸酯（CA4P）是CA4的水溶性的磷酸酯化前体药物，是第1个低于最大耐受量（MTD）就可以选择性地产生抗肿瘤血管作用的小分子血管破坏药物[1]。CA4P不仅可特异性作用于肿瘤血管系统而不影响正常组织，快速破坏实体肿瘤血管，阻断肿瘤血液供应，而且具有抑制癌细胞增长及放化疗增敏的作用[2]，该药在国外已进入Ⅲ期临床研究阶段。CA4P注射剂对光和热不稳定，在动物体内半衰期短，在体内消除很快[3-4]。鉴于此，笔者将其包封于生物可降解的高分子聚合物囊泡中，增加了药物的稳定性，使CA4P缓慢持续释放，延长其在体内的作用时间，减少给药频率；并能通过纳米囊泡的肿瘤组织增强渗透滞留作用（EPR effect）使CA4P被动靶向于肿瘤组织，从而提高疗效、降低毒副作用。本文采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定CA4P聚合物/囊泡中CA4P的含量，系统地考察了方法的准确度、精密度及稳定性等，以期为CA4P聚合物/囊泡的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

AL104精密电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；1100 HPLC仪（美国Agilent公司）；TU-1800PC/SPC紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 药品与试剂

CA4P对照品（四川大学提供，批号:20110310，纯度:99.6%）；CA4P聚合物/囊泡（浙江大学药学院药物制剂研究所，批号:20120718、20120719、20120720，含量:含CA4P 190 μg/ml）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-甲醇-0.02 mol/L乙酸铵（10∶40∶50，pH为6.6），流速:1.0 ml/min；检测波长:288 nm；进样量:20 μl。

2.2 溶液的制备

对照品贮备液:精密称取CA4P对照品适量，用流动相配制成含CA4P 210 μg/ml的溶液，摇匀即得。

对照品溶液:精密量取CA4P对照品贮备液适量，用流动相稀释成含CA4P 10.5 μg/ml的溶液，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

供试品溶液:精密量取CA4P聚合物/囊泡溶液400 μl置于5 ml棕色量瓶中，用1 ml乙腈破坏囊泡，使药物从囊泡中释放出来，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

阴性对照溶液:取不加CA4P的空白囊泡溶液400 μl置于5 ml棕色量瓶中，用1 ml乙腈破坏囊泡，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 检测波长的选择

取上述对照品溶液，在600～190 nm波长范围内进行波长扫描，确定最大吸收波长。结果显示，对照品溶液在288 nm波长处左右有最大吸收，故选定288 nm为测定波长。

2.4 系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下，取空白溶液（溶剂）、阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液（批号:20120718）进样，结果显示，理论板数按CA4P峰计算＞3000，供试品中CA4P峰与相近峰分离清晰完全，分离度＞1.5，空白和阴性对照溶液对CA4P主峰未见干扰，见图1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图A.空白；B.阴性对照；C.对照品；D.供试品；1.CA4PFig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.blank；B.negative control；C.reference substance；D.test sample；1.CA4P

2.5 线性关系考察

精密量取CA4P对照品贮备液（210 μg/ml）100、200、500 μl及1、2 ml，分别置于10 ml棕色量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤。分别精密吸取续滤液20 μl注入色谱仪，记录色谱图。以CA4P的峰面积（y）为纵坐标、CA4P的质量浓度（x）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝29.651x－9.6083（r＝0.9999）。结果表明，CA4P检测质量浓度线性范围为2.1～42 μg/ml。

2.6 检测限与定量限试验

以CA4P的色谱峰信噪比为3时的质量浓度为检测限，信噪比为10时的质量浓度为定量限。取标准曲线最低质量浓度（2.10 μg/ml）对照品溶液稀释10倍后进样检测，其信噪比＞3，因此检测限定为0.21 μg/ml；稀释3倍后进样检测，其信噪比＞10，因此定量限定为0.70 μg/ml，结果见图2。

2.7 精密度试验

取CA4P对照品溶液，分别注入色谱仪测定5次，记录峰面积，计算其RSD＝1.53%（n＝5），表明该方法精密度良好。

2.8 重复性试验

分别精密量取6份同一批号（20120718）CA4P囊泡400 μl，按供试品溶液的制备和测定法进行操作，测定CA4P含量，计算其RSD＝0.85%（n＝6），表明该方法重复性较好。

2.9 加样回收率试验

图2 检测限和定量限试验高效液相色谱图A.检测限试验；B.定量限试验Fig 2 HPLC chromatograms of detection limit and quantification limit testsA.detection limit test；B.quantification limit test

分别精密量取200 μl同一批号（20120718）已知CA4P含量的CA4P囊泡9份，置于5 ml棕色量瓶中，分3组，分别加入高、中、低相应量的CA4P对照品贮备液，用1 ml乙腈破坏囊泡使药物从囊泡中释放出来，用流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，分别测定CA4P含量，计算回收率。结果平均回收率为96.72%，RSD＝1.61%（n＝3），表明该方法的准确度较好，详见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.10 稳定性试验

取供试品溶液分别于配制后0～8 h内，每2 h测定1次，结果含量的RSD＝1.75%（n＝5），表明供试品溶液在配制后8 h内稳定。

2.11 样品含量测定

分别精密量取3批CA4P囊泡各3份，按供试品溶液处理方法制备供试品溶液，分别测定CA4P含量，结果见表2。

表2 3批样品中CA4P含量测定结果（n＝3）Tab 2 Content determination results of CA4P in 3 batches of samples（n＝3）

3 讨论

经扫描，CA4P在288 nm波长左右有最大吸收，与文献[5]基本一致，故选择288 nm为测定波长。与文献中流动相条件为磷酸二氢钾缓冲盐相比[10]，本研究使用乙酸铵缓冲盐能防止峰拖尾、改善峰形，且更有利于保护色谱柱。因CA4P对光和热不稳定[6]，在囊泡制备及含量测定过程中应注意避光操作。由于CA4P被包封于生物可降解高分子聚合物囊泡中，要测定包载在聚合物囊泡内的CA4P的量，必须将囊泡破坏使药物从囊泡中完全释放出来。因制备囊泡所用的高分子聚合物材料能溶于乙腈中，故采用乙腈破坏囊泡。经重复性试验及加样回收率试验证明，CA4P能够完全从囊泡中释放出来，方法的准确度及重复性均较好。

以上结果表明，RP-HPLC法测定聚合物囊泡中CA4P的含量，方法简便、准确度、精密度、重复性、稳定性好，可有效控制聚合物囊泡中CA4P的含量。

[1]Dark GG，Hill SA，Prise VE，et al.Combretastatin A-4，an agent that displays potent and selective toxicity toward tumor vasculature[J].Cancer Research，1997，57（10）:1829.

[2]Prise VE，Honess DJ，Stratford MR，et al.The vascular response of tumor and normal tissues in the rat to the vascular targeting agent，combretastatin A-4-phosphate，at clinically relevant doses[J].Int J Oncol，2002，21（4）:717.

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[5]尹佳，张亚兰，莫毅，等.CA4P脂质体的制备工艺研究[J].华西药学杂志，2009，24（6）:594.

[6]尹华熙，吴萍，徐小平，等.抗肿瘤新药CA4P及其有关物质的IR结构解析[J].华西药学杂志，2008，23（5）:523.