胆总管囊肿患者与巨细胞病毒感染关系的相关性

许沈南?李佳杰?卢旭生?张伟亮

【摘要】 目的 探索人巨细胞病毒感染与胆总管囊肿的相关性。方法 使用人巨细胞病毒荧光定量PCR分别对25例胆总管囊肿和20例对照组患者肝脏组织进行检测， 同时进行病理染色和人巨细胞病毒晚期蛋白免疫组化检测。结果 对照组均为检测到阳性结果， 实验组中， 人巨细胞病毒阳性14例（阳性率56%）。免疫组化结果显示阳性蛋白多位于肝细胞、血管内皮细胞、炎症浸润细胞当中， 胆管上皮细胞呈强阳性反应。结论 胆总管囊肿与人巨细胞病毒感染之间存在密切相关性。

【关键词】 巨细胞病毒感染；胆总管囊肿

先天性胆总管囊肿（congenital choledochal cyst， CCC）是一种伴有胆汁淤积的外科胆道疾病， 是胆道系统常见先天畸形[1]。小儿胆总管囊肿穿孔在小儿时期很少见， 一旦出现则病情重， 早期诊断较困难， 其发病机理至今尚不清楚。在临床诊治中发现巨细胞病毒（cytomegalo virus）与穿孔有一定的关联[2]， 相关实验也提示该病与人巨细胞病毒感染之间存在相关性。因此本实验对胆总管囊肿患者及对照组患者肝脏组织中的人巨细胞病毒进行检测， 为检验和论证胆总管囊肿与人巨细胞病毒感染之间的相关性问题提供实验数据。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 新鲜肝脏组织标本源自普宁市人民医院2010年～2013年施行手术的25例胆总管囊肿患者， 其中男13例， 女12例。全部病例手术时年龄在2～8岁， 平均（4±2）岁。同时收集对照组病例20例， 均来自于本院意外死亡尸检小儿。

1. 2 方法 全部行B超及CT检测， 诊断为胆总管囊肿， 手术中进一步探查， 证实为胆总管囊肿。术中切取直径约1 cm的肝右叶边缘组织， 分成两份， 一份用甲醛固定， 另一份于-80℃超低温冰箱中保存。

2 主要试剂及设备

DNA提取试采用 QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit， 人巨细胞病毒检测使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸扩增荧光定量检测试剂盒， HCMV 晚期蛋白PP65单克隆抗体购自美国 USCNLIFE 公司， 为兔抗人单克隆抗体， 其余免疫组化试剂均购自DAKO公司。

3 荧光定量PCR

取约40 mg的肝脏标本提取DNA， 提取过程严格按照QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit操作说明书进行。荧光定量PCR反应条件及结果判定均按照相应的试剂盒说明书进行， 反应结束后使用7300 system SDS software进行数据处理与分析。具有反应条件， 详见表1。

表1 5种病毒FQ-PCR反应条件

病毒名称 第一步 第二步 第三步 第四步

HCMV 93℃ 2 min 93℃ 45 s，55℃ 60 s，10个循环 93℃ 30 s 55℃ 45 s，30个循环

4 病理及免疫组织化学染色

肝脏组织使用甲醛固定后， 包埋成石蜡块并进行切片。病理染色方法包括HE 染色和MASSON染色。于此同时， 采用二步法对人巨细胞病毒晚期蛋白PP65进行免疫组织化学染色， 以包浆内有明显棕黄色为阳性。

5 结果

5. 1 人巨细胞病毒在胆总管囊肿组织中的感染率 PCR结果显示：25例胆总管囊肿患者肝脏组织中， HCMV阳性者14例子， 阳性率56%， 对照组20例HCMV均为阴性。

5. 2 胆总管囊肿组织病理变化 胆总管囊肿患者肝脏组织病理结果显示：肝小叶有不同程度的变性坏死， 部分可见肝多核巨细胞， 汇管区胆栓形成， 胆小管增生， 胆道上皮细胞变性。以胆小管为中心， 炎症细胞侵润， 不同程度的纤维束包裹胆小管。详见图1。

5. 3 胆总管囊肿组织PP65分布情况 PCR检测HCMV检测阳性者， PP65免疫组化染色可见：PP65 均位于感染细胞胞浆当中， 阳性细胞多较集中分布于肝细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和炎性浸润细胞， 胆道上皮细胞呈强阳性表达。详见图2。

6 讨论

CMV是一种DNA病毒。HCMV是人体最常见的机会性感染病毒之一。用检测方法调查HCMV感染率， 发达国家人群感染率40%～60%， 发展中国家95%～99%。近年来， 随着研究的深入， 很多学者已认识到胆总管囊肿不能简单归于先天性疾病， 而更可能是围生期的一种进行性病变。其明显的季节和地区聚集趋势的特点提示该病可能与环境中某种感染因素的损伤有关[2]。随后相关的研究也表明病毒感染与胆总管囊肿存在相关性[3]。

但具体是哪一种病毒却值得探索， 近年来人们采用多种方法对胆总管囊肿和多种病毒感染之间的相关性问题进行研究， 相关研究也证实该病与多种病毒之间存在相关性， 其中主要病毒包括呼肠病毒、轮状病毒和巨细胞病毒3大类[4-6]。

本实验使用PCR方法直接检测患者肝脏组织当中HCMV的阳性率， 并使用尸检患儿肝脏组织作为对照组， 实验结果显示胆总管囊肿患者的阳性率高达56%， 而对照组则未有阳性病例。此数据与国内董永绥等[7]进行大规模前瞻性研究得出的普通婴幼儿CMV肝炎发生率（42%）相比， 提示BA病因为HCMV感染的可能。进一步提示了胆总管囊肿与巨细胞病毒的相关性。

于此同时， 作者注意到胆总管囊肿患者的胆道上皮细胞上HCMV晚期蛋白PP65的表达呈强阳性， 且胆道上皮细胞亦出现凋亡现象。提示HCMV对胆总管囊肿患儿的胆道上皮细胞具有侵袭性， 可诱发胆道上皮细胞的凋亡， 从而影响胆小管的功能与结构。

将通过动物学实验进一步证实本次研究的检测结果， 将HCMV打入到胎鼠当中， 观察其胆道的变化。HCMV与胆总管囊肿之间存在相关性， 可谓临床上胆总管囊肿的防治提供科研依据， 造福患儿。

参考文献

[1] Alford CA， Stagno S， Pass RF， Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis ， 1990， 125Suppl7：S745-753.

[2] Wu T C， Hruban R H， Ambinder R F， et al. Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts. The American journal of pathology， 1992， 140（3）： 739.

[3] 冯杰雄.病毒感染与胆总管囊肿的关系.实用儿科临床杂志， 2007， 22（ 23）：1761-1763.

[4] Szavay PO， Leonhardt J， Czech-Schmidt G， et al. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. Eur J Pediatr Surg， 2002， 12（4）：48-50.

[5] Bobo L， Ojeh C， Chiu D， et al. Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia. Pediatr Res， 1997， 41（2）：229-234；

[6] De Tommaso AM， Andrade PD， Costa SC， et al. High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extra-hepatic neonatal cholestasis. BMC Infect Dis， 2005， 12（1）：108；

[7] 董永绥， 方峰， 魏晶， 等.巨细胞病毒感染的母婴传播研究.中国实用儿科杂志， 2000， 15（3）： 334-335.

参考文献

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