香菇多糖对小鼠T淋巴细胞膜上离子通道基因表达的影响

刘国欣，邢建国，李明春，付青姐，张彬（1.石河子大学药学院，新疆 石河子 8000；.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 80000；.解放军第401医院，山东 青岛 66000）

T淋巴细胞是生物体内最重要的免疫活性细胞之一，主行细胞免疫应答，并参与体液免疫应答，在人体的免疫系统功能中发挥着重要作用。T淋巴细胞膜上主要有电压门控钾离子通道（KV1.3）、Ca2+激活的钾离子通道（KCa3.1）、阳离子通道（TRPM7）、氯离子通道（Clswell）4种离子通道[1]以及钙离子通道（CRAC）激活的调控元件[基质相互作用因子（STIM）1和组成分子orai1]，这些离子通道的活动与离子跨膜运动、膜电位变化以及T淋巴细胞活化、增殖密切相关。KV1.3受膜电位控制，主要维持T淋巴细胞的静息膜电位，它功能异常时，静息电位降低，可抑制Ca2+进入细胞，故它可以通过影响Ca2+浓度来影响T淋巴细胞的激活与功能，此外还参与T淋巴细胞的体积调节过程。KCa3.1受细胞内Ca2+浓度调节，细胞内Ca2+浓度升高是KCa3.1开放的主要原因，它在T淋巴细胞的活化过程中具有重要的作用[2]。T淋巴细胞上CRAC是细胞外Ca2+进入细胞的唯一通路，它通过调控细胞内Ca2+浓度来调控T淋巴细胞的活动[1]。TRPM7是一种非选择性的阳离子通道，对Ca2+、Mg2+、K+、Na+在内的众多阳离子有通透性[3]，同时作为一种蛋白激酶可使自身或底物磷酸化[4]。Clswell是T淋巴细胞上的Cl－通道，正常状态下不开放，当细胞体积增大时，激活Clswell通道，Cl－由细胞内流向细胞外，直至细胞体积恢复至原来体积时Clswell通道关闭[1]。总之，T淋巴细胞膜上的离子通道作为T淋巴细胞内信号转导的一条重要途径，在T淋巴细胞的激活、分化等其他功能中具有重要作用。

香菇多糖是从担子菌伞科真菌香菇子实中提取出来的β-1，3-d-葡聚糖，从1970年Chihara第一次报道证实香菇多糖具有很强的抗肿瘤活性后，它被陆续证实具有明显的抗菌、提高机体免疫等作用[3]。香菇多糖注射液作为一种具有免疫调节作用的抗肿瘤辅助药物，广泛应用于临床，调查显示它在许多医院中药制剂的应用中排在前三位[5]。目前，对香菇多糖促进T淋巴细胞增殖与活化的机制研究相对较少，并且对T淋巴细胞的增殖与活化是否与T淋巴细胞膜上的离子通道有关的研究仍未见报道。本研究将从基因水平对香菇多糖的作用机制进行研究，主要针对香菇多糖对小鼠T淋巴细胞膜上的离子通道基因表达的影响进行探讨。

1 材料

1.1 仪器

DynaMag-15型磁力架（美国Life Technologies公司）；超低温冰箱（青岛澳柯玛电器公司）；TL988型实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪（西安天隆科技有限公司）；MTC100型恒温混匀仪（杭州米欧仪器有限公司）；TGL16型高速低温离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

香菇多糖注射液（金陵药业股份有限公司，批号:121001.1，规格:1.0mg/2ml）；胎牛血清、免疫磁珠试剂盒（美国Hyclone公司）；RNA提取试剂盒、引物（基因序列见表1）、cDNA试剂盒、RNA扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

表1 基因序列Tab 1 Gene sequences

1.3 动物

健康KM小鼠40只，6～8周，♂，体质量（24±4）g，由山东青岛实验动物与动物实验中心提供[实验动物使用许可证号:SCXK（鲁）20090007]。

2 方法

2.1 分组与给药

40只KM小鼠随机均分为4组，即对照（等容生理盐水）组与香菇多糖高、中、低剂量（12.5、2.5、0.5mg/kg）组。ip给药，每天1次，连续30d。

2.2 T淋巴细胞的提取

末次给药1 h后，处死小鼠，取出脾脏，置于冷PBS（含0.1%胎牛血清+0.02%柠檬酸钠）中，用免疫磁珠法从脾脏中提取T淋巴细胞。

2.3 qRT-PCR的测定

收集细胞，Trizol法提取RNA，鉴定完RNA纯度和完整性后，反转录制备cDNA；PCR条件为:95℃预变性30 s；95℃变性15 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，循环数40次；72 ℃延伸5min终止反应。qRT-PCR结束后，定量分析PCR获得的熔解曲线和扩增曲线结果的可靠性并设定循环阈值（Ct），以目的基因/β-actin比值分别代表各自相对表达水平。各组设3个复孔，实验重复3次。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞KV1.3 mRNA表达的影响

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞KV1.3 mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞上KV1.3 mRNA表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞KV1.3 mRNA的表达见图1。

图1 小鼠脾脏T淋巴细胞KV1.3 mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 1 mRNA expression of KV1.3 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.2 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞KCa3.1 mRNA表达的影响

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞KCa3.1 mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞上KCa3.1 mRNA的表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞KCa3.1 RNA的表达见图2。

3.3 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞orai1 mRNA表达的影响

图2 小鼠脾脏T淋巴细胞KCa3.1 mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 2 mRNA expression of KCa3.1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞orai1 mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞CRAC通路上的调控元件orai1 mRNA表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞orai1 mRNA的表达见图3。

图3 小鼠脾脏T淋巴细胞orai1 mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 3 mRNA expression of orai1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.4 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞STIM1 mRNA表达的影响

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞STIM1 mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞CRAC通路上的调控元件STIM1 mRNA表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞STIM1 mRNA的表达见图4。

图4 小鼠脾脏T淋巴细胞STIM1 mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 4 mRNA expression of STIM1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.5 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞TRPM7 mRNA表达的影响

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞TRPM7 mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞上TRPM7 mRNA表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞TRPM7 mRNA的表达见图5。

图5 小鼠脾脏T淋巴细胞TRPM7 mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 5 mRNA expression of TRPM7 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.6 香菇多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞Clswell mRNA表达的影响

与对照组比较，香菇多糖中剂量组小鼠脾脏T淋巴细胞Clswell mRNA表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，中剂量香菇多糖可以使小鼠脾脏T淋巴细胞上Clswell mRNA表达增强。小鼠脾脏T淋巴细胞Clswell mRNA的表达见图6。

图6 小鼠脾脏T淋巴细胞Clswell mRNA的表达与对照组比较:＊P＜0.05Fig 6 mRNA expression of Clswell in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

4 讨论

香菇多糖主要用于肿瘤患者，临床试验证明，它对人的恶性肿瘤具有有效的抑制作用[6]。它主要的作用机制是促进T、B淋巴细胞增殖[7]，提高自然杀死（NK）细胞的活性，调节免疫力，从而维持机体内环境稳定，同时它还能促进T淋巴细胞产生一氧化氮（NO）、白细胞介素（IL）-2来抵抗放疗对机体的损伤[8]。T淋巴细胞上的CRAC是细胞外Ca2+进入细胞内的重要通路[1]。STIM1和orai1作为CRAC通路中的调控元件作用于内质网上的Ca2+库，以致Ca2+持续释放到细胞液内，使游离Ca2+浓度升高，一定浓度的Ca2+与STIM1、orai1共同作用使细胞外的Ca2+进入到细胞内，使细胞内的Ca2+浓度升高[9]。Ca2+作为第二信使，浓度升高能够激活细胞内的基因表达，活化T淋巴细胞。Ca2+浓度升高还能激活离子通道KCa3.1，研究表明，KCa3.1的高表达能够强烈地增强T淋巴细胞的活性并促进其增殖[10]。早在1988年就有研究表明，钾离子通道的高表达能够迅速地使小鼠胸腺细胞增殖[11]。KV1.3通道的表达与激活T淋巴细胞的活性以及增殖有着密切的关系[12]。qRT-PCR结果显示，中剂量香菇多糖使KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表达明显增强，因此可以推断香菇多糖可以明显增强小鼠T淋巴细胞的增殖和活性，其机制与影响KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表达有密切关系。

香菇多糖对细胞的体积具有一定的调控作用。T淋巴细胞上的Clswell在T淋巴细胞的体积调节过程中发挥着至关重要的作用，因此又称它为容量调控氯离子通道[1]。通常Clswell与钾离子通道共同作用使容积变大的T淋巴细胞恢复至正常体积，从而使T淋巴细胞内环境稳定，发挥细胞免疫的功能。TRPM7是一种非选择性的阳离子通道，对Ca2+、Mg2+、K+、Na+等众多二价和单价阳离子有通透性，同时又是一种蛋白激酶，可使自身或底物磷酸化[4]。在T淋巴细胞的增殖活化过程中离不开底物磷酸化，同时，在T淋巴细胞正常功能的维持过程中离不开Ca2+、Mg2+、K+、Na+等众多二价和单价阳离子平衡。因此，在T淋巴细胞的增殖活化过程中离不开Clswell通道和TRPM7通道。由此推断香菇多糖对T淋巴细胞的一系列作用与对Clswell通道和TRPM7通道的基因表达关系密切。

Attia SM等[13]研究表明，香菇多糖对DNA的损伤修护作用具有剂量依赖性。付青姐等[14]研究香菇多糖保护小鼠脾脏抵御辐射损伤的实验结果表明，香菇多糖在2.5、0.5mg/kg的剂量下可明显缓解辐射造成的脾脏损伤。许多研究也证实，香菇多糖的免疫调节作用具有一定的剂量依赖性。本研究表明，香菇多糖在不同剂量下基因的表达有一定差异性，所有的基因表达结果显示，中剂量的香菇多糖能够使5种离子通道的基因表达上调，而高剂量和低剂量香菇多糖对5种离子通道的基因表达虽有所影响，但是均不具有统计学意义，说明香菇多糖在适宜剂量下可以上调5种离子通道的基因表达，调节T淋巴细胞活性，从而发挥免疫调节的作用。

综上所述，香菇多糖具有增加T淋巴细胞的增殖和活性、调节免疫的作用，与提高离子通道KV1.3、KCa3.1、TRPM7、Clswell以及Ca2+通道调控元件STIM1、orai1的基因表达有密切关联。

[1]Cahalan MD，Chandykg.The functional network of ion channels in T lymphocytes[J].Immunol Rev，2009，231（1）:59.

[2]Kuras Z，Yun YH，Chimote AA，et al.KCa3.1 and TRPM7 Channels at the uropod regulate migration of activated human T cells[J].PLoS One，2012，7（8）:e43859.

[3]Baldoli E，Castiglioni S，Maier JA.Regulation and function of TRPM7 in human endothelial cells:TRPM7 as a ootential novel regulator of endothelial function[J].PloS One，2013，8（3）:e59891.

[4]田舜莲，江慧，施静.TRPM7:一种具有离子通道和激酶活性的双功能膜蛋白[J].生理科学进展，2009，40（3）:253.

[5]刘丽娟，季波.我院2010年中药注射剂应用情况分析[J].中国药房，2011，22（35）:3342.

[6]Wang G，Lin W，Zhao R，et al.Effects of six polysaccharides extracted from plants on the immunological cells of mice[J].Wei Sheng Yan Jiu，2008，37（5）:577.

[7]林卡莉，陈同强，黄志华，等.香菇多糖对荷瘤鼠免疫细胞及生存率的影响[J].时珍国医国药，2009，20（12）:3077.

[8]Wang Y，Li MC，Fu QJ.Protective effects of lentinan against T lymphocytes injury in mice under chronic radiation stress[J].Chinese Herbal Medicines，2013，5（1）:62.

[9]Rao A，Hogan PG.Calcium signaling in cells of the immune and hematopoietic systems[J].Immunol Rev，2009，231（1）:5.

[10]Beeton C，Wulff H，Barbaria J，et al.Selective blockade of T lymphocyte K（+）channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis，a model for multiple sclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（24）:13942.

[11]Lewis RS，Cahalan MD.The plasticity of ion channels:parallels between the nervous and immune systems[J].Trends Neurosci，1988，11（5）:214.

[12]Hu L，Pennington M，Jiang Q，et al.Characterization of the functional properties of the Voltage-Gated potassium channel KV1.3 in human CD4+T lymphocytes[J].J Immunol，2007，179（7）:4563.

[13]Attia SM，Harisa GI，Abd-Allah AR，et al.The influence of lentinan on the capacity of repair of DNA damage and apoptosis induced by paclitaxel in mouse bone marrow cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2013，27（7）:370.

[14]付青姐，李明春，柳迎华.辐射对小鼠脾脏损伤及香菇多糖的保护作用[J].中国现代应用药学，2013，30（6）:606.