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RP-HPLC法同时测定人血浆中马钱子4种生物碱的含量

2014-05-21翁德新戴其昌德清县第三人民医院药剂科浙江德清31300湖州市食品药品检验所浙江湖州313000

中国药房 2014年15期
关键词:马钱子氮氧化物生物碱

翁德新,戴其昌(1.德清县第三人民医院药剂科,浙江 德清 31300;.湖州市食品药品检验所,浙江 湖州 313000)

马钱子,也称番木鳖,为马钱科植物马钱Strychnos nuxvomica L.或云南马钱S.pierriana A.W.Hill的干燥成熟种子,其味苦、性寒、有大毒,在中医药临床上用于通络止痛、散结消肿。现代医学理论证明,马钱子具有抗肿瘤作用[1]。马钱子中的各种生物碱是马钱子的主要有效部位,其中番木鳖碱(Strychnine)、马钱子碱(Brucine)、番木鳖碱氮氧化物(Strychnine N-oxide)和马钱子碱氮氧化物(Brucine N-oxide)是较为重要的生物碱[2-4]。马钱子的体内分析研究较少,通常是单一成分检测或两种成分一起检测[5],目前未见4种成分一起检测的方法。本研究建立了同时检测人血浆中马钱子4种生物碱类成分含量的方法,以为马钱子的体内药动学分析提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱(HPLC)仪(日本岛津公司);AE-240S型十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);KQ-100型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司);涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂);3K15型离心机(德国Sigma公司)。

1.2 药品与试剂

番木鳖碱(批号:110705-200306)、马钱子碱(批号:110706-200505)、石杉碱甲(批号:100243-200601)对照品均购自中国食品药品检定研究院;番木鳖碱氮氧化物、马钱子碱氮氧化物对照品(德国Carl GmBH公司,纯度均>98%);十二烷基硫酸钠为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:HYP-ODS C18(250mm×4.6mm,5 μm);流动相:乙腈-0.2%十二烷基硫酸钠溶液(40∶60,V/V,pH2.8);流速:1.0ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:254nm;进样量:20μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒质量的番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物对照品适量,用流动相溶解并定容至同一25ml量瓶中,制备成质量浓度分别为0.356mg/ml(番木鳖碱)、0.357mg/ml(马钱子碱)、0.356mg/ml(番木鳖碱氮氧化物)、0.355mg/ml(马钱子碱氮氧化物)的混合对照品溶液,即为混合对照品母液,4℃贮藏,备用。精密移取混合对照品母液0.5ml,置1ml量瓶中,用甲醇定容,混匀,即为混合对照品系列溶液①。再分别精密移取混合对照品系列溶液①3ml,置10ml量瓶中,用甲醇定容,混匀,为混合对照品系列溶液②。然后分别精密移取混合对照品系列溶液②0.5、1、5、10、20、50ml,置50ml量瓶中,用甲醇定容,混匀,得混合对照品系列溶液③~⑧,其中番木鳖碱的质量浓度分别为0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml,马钱子碱的质量浓度分别为0.54、1.07、5.36、10.71、21.42、53.55μg/ml,番木鳖碱氮氧化物的质量浓度分别为0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml,马钱子碱氮氧化物的质量浓度分别为0.53、1.06、5.33、10.65、21.30、53.25μg/ml。4 ℃贮藏,备用。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒质量的石杉碱甲对照品适量,以甲醇溶解制得质量浓度为40.02μg/ml的内标溶液。4℃贮藏,备用。

2.2.3 质控样品的制备 分别取“2.2.1”项下混合对照品系列溶液10μl与内标液10μl,置50μl空白血浆中,得高、中、低质量浓度的质控样品,即番木鳖碱血浆浓度分别为53.40、10.68、0.50μg/ml、马钱子碱血浆浓度分别为53.55、10.71、0.54μg/ml、番木鳖碱氮氧化物血浆浓度分别为53.40、10.68、0.50μg/ml,马钱子碱氮氧化物血浆浓度分别为53.25、10.65、0.53μg/ml。-20℃贮藏,备用。

2.3 血浆样品的处理

精密吸取人血浆样品50μl,加入“2.2.1”项下混合对照品系列溶液50μl、石杉碱甲20μl、氨水20μl,涡旋2min,再加入乙腈600μl沉淀蛋白,涡旋3min,以离心半径为13.5 cm、15000 r/min离心 5min,取上清液20μl进样。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 取“2.2.3”项下中质量浓度的质控样品溶液适量,按“2.3”项下方法处理后,按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明,马钱子碱氮氧化物、石杉碱甲、番木鳖碱氮氧化物、番木鳖碱和马钱子碱的保留时间分别为3.5、5.2、7.3、24.7、30.8min,血浆中所含的内源性物质不干扰被测物和内标的测定,且峰形良好。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图1.马钱子碱氮氧化物;2.石杉碱甲;3.番木鳖碱氮氧化物;4.番木鳖碱;5.马钱子碱Fig 1 HPLC chromatograms1.brucine N-oxide;2.huperzine A;3.strychnine N-oxide;4.strychnine;5.brucine

2.4.2 标准曲线的制备 取“2.2.1”项下混合对照品系列溶液③~⑧,按“2.3”项下方法处理,按“2.1”项下色谱条件进样测定。以待测物质量浓度(x)为横坐标,待测物的峰面积积分值(y)为纵坐标,进行线性回归。回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围(n=6)Tab 1 Regression equation and linear range(n=6)

2.4.3 精密度试验 按“2.2.3”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品,按“2.3”项下方法处理,按“2.1”项下色谱条件测定日内精密度(6次)、日间精密度(6 d)。结果,番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物、马钱子碱氮氧化物日内、日间精密度的RSD均小于9.0%,表明本方法精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下中质量浓度的质控样品溶液5份,置4℃下24h后测定,考察血浆样品的短期稳定性;另取该溶液5份,贮藏于-70℃,30d后测定,考察血浆样品的长期稳定性;再取该溶液5份,在室温中充分解冻,然后再次冷冻,每次间隔24h,重复3个冻融周期后测定,考察血浆样品的3周期冻融稳定性。稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果(n=5)Tab 2 Results of stability tests(n=5)

2.4.5 提取回收率试验 取“2.2.3”项下高、中、低质量浓度的质控样品适量,按“2.3”项下方法处理,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。与未经处理的相应质量浓度的对照品溶液峰面积比较,计算番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的回收率,结果见表3。

表3 提取回收率试验结果(n=6)Tab 3 Results of extraction recovery tests(n=6)

3 讨论

马钱子在炮制为制马钱子过程中,番土鳖碱和马钱子碱可转化成相应的氮氧化合物[6],可能在体内会转化为极性更高的氮氧化合物,而且其氮氧化合物与原生物碱的药理药效相当[7],因此研究番土鳖碱、马钱子碱、番土鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物具有参考价值。

2010年版《中国药典》对番木鳖碱和马钱子碱进行HPLC测定,流动相为庚烷磺酸钠[8],本课题组参考文献[9]的流动相用十二烷基硫酸钠替代庚烷磺酸钠,调pH为2.8,未加磷酸二氢钠,流动相的制备更方便简单,也获得了较好的分离效果。

番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物均为碱性物质[10],本研究采用氨水碱化血样,使得各生物碱以游离分子形式存在,从而提高了生物碱从血浆提取的效率,与王丹丹等[11-12]采用三乙胺作为流动相有相似的原理。有研究采用氯仿提取并溶解番木鳖碱,但笔者筛选了几种有机溶液,发现乙腈的提取率最高,而采用氯仿提取时处理有难度,且番木鳖碱在放置过程中有降解,与文献结果相似[13]。

综上所述,本研究采用RP-HPLC法同时测定人血浆中马钱子4种生物碱的含量,本方法简单、快速、灵敏和准确,可以作为马钱子4种生物碱的药动学研究方法。

[1]赵立民,刘玉国,徐恒卫.马钱子碱对大鼠慢性胃炎胃癌癌前病变模型的保护作用研究[J].中国药房,2012,23(35):3285.

[2]Yin W,Wang TS,Yin FZ,et al.Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnos nux-vomica[J].J Ethnopharmacol,2003,88(2/3):205.

[3]Yin W,Deng XK,Yin FZ,et al.The cytotoxicity induced by brucine from the seed of Strychnos nux-vomica proceeds via apoptosis and is mediated by cyclooxygenase 2 and caspase 3 in SMMC 7221 cells[J].Food Chem Toxicol,2007,45(9):1700.

[4]屈艳格,陈军,王冬月,等.马钱子生物碱类成分经口给药后在大鼠体内的药动学研究[J].中草药,2013,44(8):1008.

[5]肖寒露,陈军,蔡宝昌.HPLC同时测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的浓度[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(11):26.

[6]Hu J,Wu Z,Hu K,et al.Preparation and characterization of niosomes of Semen Strychni alkaloids extract[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2011,36(14):1955.

[7]Chen X,Lai Y,Cai Z.Simultaneous analysis of strychnine and brucine and their major metabolites by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry[J].J Anal Toxicol,2012,36(3):171.

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[10]Tang HB,Cai HL,Li HD,et al.HPLC-DAD method for comprehensive quality control of Semen Strychni[J].Pharm Biol,2013,51(11):1378.

[11]王丹丹,李俊松,蔡宝昌.HPLC法同时测定制马钱子中4种生物碱类成分的含量[J].药学与临床研究,2008,16(6):523.

[12]杨艳娇,刘雅敏,白月明,等.HPLC法测定骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的含量[J].风湿病与关节炎,2013,2(12):39.

[13]王豫辉,胡海廷,牛家萍.HPLC测定腰痛宁胶囊中士的宁的含量[J].中国药学杂志,1998,33(11):698.

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