双波长HPLC法同时测定妇科Ⅳ颗粒剂中芍药苷和虎杖苷的含量

钱 俊，林 夏，王星星，刘莉莉，吴 云，萧 伟

江苏康缘药业股份有限公司 中药制药过程新技术国家重点实验室，连云港 222001

妇科Ⅳ颗粒剂是根据江苏省中医院治疗慢性盆腔炎的临床经验方经提取、精制而成。处方由蒲公英、党参、大血藤、虎杖、赤芍、延胡索、皂角刺等中药材组成，具有清热除湿、化瘀止痛之功效。方药以蒲公英等为君药，具有益气清热的作用；以虎杖等为臣药，具有清热通络的作用；以赤芍等为佐药，具有清热活血散瘀的作用。虎杖具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效，其中活性成分虎杖苷具有抗菌、抗血栓形成、抗内毒素、降低全血黏度等作用[1-2]。赤芍具有清热凉血、散瘀止痛的功效，以芍药苷为主的总苷为其主要活性成分，有非常明显的抗凝血、抗血小板聚集及改善血液流变学异常，抗血栓形成的作用[3-4]。2010版《中国药典》中虎杖及赤芍采用高效液相色谱法对虎杖苷和芍药苷进行含量测定[5]，文献报道的虎杖苷、芍药苷含量测定方法多为单波长单项含量测定。为有效控制本制剂质量，本研究采用高效液相色谱法同时检测制剂中虎杖苷和芍药苷含量，具有检测灵敏度高，节省时间及成本低等优点，提高了分析效率，所建立的含量测定方法可靠、准确、重现性好，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

Waters 2695-2487液相色谱仪。

芍药苷对照品（批号：0736-200934）、虎杖苷对照品（批号：111575-200502）均购自中国食品药品检定研究院；妇科Ⅳ颗粒剂（批号：130901、130902、130903，江苏康缘药业股份有限公司）；乙腈（色谱纯，上海陆都化学试剂厂）；其余试剂为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果[5-6]

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液精密称取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的芍药苷、虎杖苷对照品适量，加甲醇制得每毫升含芍药苷209.6 μg、虎杖苷137.5 μg的混合对照品溶液。摇匀，备用。

2.1.2 供试品溶液取本品适量，混匀研细（过60目），取细粉约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密称定，超声处理0.5 h，放置至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心取续滤液即得。

2.1.3 阴性供试品溶液分别取缺赤芍及缺虎杖的其他各味药材，按“2.1.2”项的制备方法分别制备缺赤芍阴性供试品溶液及缺虎杖阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.10%磷酸（17∶83）；检测波长：230 nm、306 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL。

2.3 系统适应性

在上述条件下，理论塔板数按芍药苷峰计算应不得低于6000，按虎杖苷峰计算应不得低于3000，分离度均大于1.5，已达到基线分离，拖尾因子在0.95～1.05之间。

2.4 专属性实验

分别精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，在230 nm及306 nm波长下分别测定。结果表明：芍药苷、虎杖苷与其他色谱峰达到基线分离，分离度均大于1.5，阴性对照液无干扰，说明在妇科Ⅳ颗粒剂中芍药苷、虎杖苷的专属性较强。色谱图见图1、图2。

图1 混合对照品溶液（A），妇科Ⅳ供试品溶液（B）和缺赤芍阴性供试品溶液（C）的230 nm处HPLC色谱图

图2 混合对照品溶液（A），妇科Ⅳ供试品溶液（B）和缺虎杖阴性供试品溶液（C）的306 nm处HPLC色谱图

2.5 线性关系考察

精密称取芍药苷和虎杖苷对照品适量，加甲醇分别制成每毫升含芍药苷为1.048 mg、含虎杖苷为0.687 mg的溶液，作为储备液。分别精密量取贮备液0.5、1、2、4、6、8 mL 至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得系列浓度混合对照品溶液，分别精密吸取各浓度混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积平均值为纵坐标进行线性回归。求得芍药苷、虎杖苷回归方程分别为 ：Y=10176X+415410 （r=0.9997）；Y=26787X+235762（r=0.9999）。 结果表明，芍药苷在 0.524 μg～8.384 μg、虎杖苷在 0.344 μg～5.502 μg，与峰面积的线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取芍药苷浓度为 209.6 μg·mL-1、虎杖苷浓度为 137.5 μg·mL-1的混合对照品溶液 10 μL，连续重复进样6次，测定峰面积，计算得芍药苷的峰面积值的RSD为0.10%，虎杖苷的峰面积值的RSD为0.13%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一供试品，共6份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件测定，测得样品中指标成分芍药苷的含量均值为9.20 mg·g-1，RSD=1.00%（n=6）；虎杖苷的含量均值为6.84 mg·g-1，RSD=1.00%（n=6）。结果表明此法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一批号供试品溶液，精密吸取10 μL，分别于 0、2、4、6、8、12 h 各进样 1 次，测得芍药苷和虎杖苷的峰面积积分值，计算，芍药苷的峰面积的RSD为1.00%，虎杖苷的峰面积的RSD为1.30%，结果表明指标成分在12 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取样品 （芍药苷含量9.20 mg·g-1，虎杖苷含量6.84 mg·g-1）适量，研细（过 60 目），平行取 6 份，0.25 g/份，精密称定，分别精密加入浓度为1.145 mg·mL-1芍药苷对照品溶液2 mL、浓度为1.710 mg·mL-1虎杖苷对照品溶液1 mL，挥干后，按“2.1.2”项下方法操作，精密吸取上述各供试品溶液10 μL，分别进样分析。芍药苷的平均回收率（n=6）为99.6%（RSD=0.92%）；虎杖苷的平均回收率 （n=6）为100.3%（RSD=1.32%）。

2.10 样品含量测定

取 3批样品，每批取 3份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件测定，分别吸取10 μL进样，采用外标一点法定量，结果见表1。

表1 样品中芍药苷、虎杖苷的含量测定结果（n=3）

3 讨 论

3.1 波长的选择。根据2010版《中国药典》及芍药苷和虎杖苷全波长扫描图，选择230 nm作为芍药苷的检测波长，306 nm作为虎杖苷的检测波长。采用具有多波长检测功能的紫外检测器在各成分最佳检测波长下同时进行检测分析，提高了检测的灵敏度及分析效率，节省了成本。

3.2 色谱条件优选考察。比较了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.10%磷酸溶液3种流动相系统，两种色谱柱 Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的分离效果，结果表明：选用乙腈-0.1%磷酸系统进行洗脱分离效果较好，两种色谱柱均能使芍药苷、虎杖苷色谱峰与相邻色谱峰达到较好的分离（Rs>1.5）。

3.3 磷酸浓度选择。流动相加入一定的磷酸是为了调节pH值，可减少拖尾，提高灵敏度[7]。比较了0.05%、0.10%、0.15%磷酸水溶液，0.05%浓度效果较后两者为差，而0.10%与0.15%浓度效果无明显差异。考虑色谱柱的保护，最终流动相选择乙腈-0.10%磷酸水溶液系统。

3.4 供试品溶液制备方法优选考察。考察了提取方式（超声、回流）、溶剂种类及浓度（甲醇、乙醇）、溶剂用量、提取时间，结果表明：以50 mL甲醇超声0.5 h可以有效地提取芍药苷和虎杖苷。

3.5 考察了不同柱温、不同流速、不同进样量对测定结果的影响，结果表明，本文所采用的色谱条件耐用性良好。

3.6 本实验用HPLC法同时测定妇科Ⅳ颗粒中2种主要有效成分含量，结果显示，该法方便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于妇科Ⅳ颗粒剂的质量控制。

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[2] 张海防，窦昌贵，顾菲菲.虎杖清热解毒药理作用的研究进展[J]. 中药材，2003，26（8）：606-10.

[3] 王琳琳，丁安伟.赤芍总苷对大鼠血瘀证模型的影响[J].南京中医药大学学报，2011，27（6）：552-4.

[4] 马双成，邓少伟.赤芍总苷的生产工艺条件研究[J].中草药，1998，29（10）：664-7.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：147，194.

[6] 程东方，谢纪珍，贾元印.HPLC法测定血康颗粒中芍药苷的含量[J]. 药学研究，2013，32（3）：150-2.

[7] 谷满仓，钱亚芳，吕圭源.白芍的化学成分及质量控制方法研究进展[J]. 科技通报，2006，22（3）：337-44.