HPLC法测定毛冬青胶囊中具栖冬青苷和毛冬青酸的含量*

赵文珠 ，居文政 ，2**，程小桂 ，臧雨馨 ，孙冰婷 ，谈恒山

1南京中医药大学 药学院，南京 210029；2南京中医药大学附属医院 临床药理科，南京 210029；3南京军区总医院，南京 210002

毛冬青胶囊为冬青科植物毛冬青 （Ilex pubescens Hook.et Arn）经提取精制而成的制剂。毛冬青是我国南方常用的中药，性寒，味苦、涩，具有活血通脉、清热解毒、祛痰止咳的功效，临床上广泛用于治疗冠心病、心绞痛、血栓闭塞性脉管炎等[1]。药理研究表明，毛冬青可明显提高心肌的cAMP（环磷酸腺苷）和cGMP（环磷酸鸟苷）水平，具有抗心律失常等作用[2]。毛冬青主要含有皂苷类成分，其中具栖冬青苷和毛冬青酸为活性成分[3]；但毛冬青胶囊中具栖冬青苷和毛冬青酸的含量测定尚未见报道。本文建立高效液相色谱法同时测定具栖冬青苷和毛冬青酸含量，为完善质控标准和进行药代动力学研究提供依据。

1 材 料

1.1 仪器

Agilent1100（包括脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器），Chem Station色谱工作站；Mettler AE 240型电子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；Micro-17R型冷冻离心机（美国Thermo公司）；Direct-Q5型超纯水机 （法国Millipore公司）；KQ3200型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

毛冬青胶囊 （广东和平药业有限公司，批号130401、130803、130804）；具栖冬青苷对照品（成都艾科达化学试剂有限公司，纯度>98%）；毛冬青酸对照品（成都普菲德生物技术有限公司，纯度>98%）；超纯水由Millipore超纯水系统制备；甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇（B）-0.2% 磷酸（D），梯度洗脱（0 min，19%B；10 min，65%B；20 min，81%B；25 min，19%B）；柱温：40 ℃；检测波长：215 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

在上述色谱条件下，具栖冬青苷和毛冬青酸的理论塔板数不低于3000，与其他峰分离度均>1.5，对照品及供试品的色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

图1 毛冬青胶囊HPLC

2.2.1 供试品溶液取毛冬青胶囊10粒，研磨均匀，精密称取2.25 g，置25 mL三角瓶中，精确加入甲醇20 mL，称重，超声处理45 min，再次称重，用甲醇补足损失重量。摇匀，12000 r·min-1离心10 min，取上清液，水浴挥干，乙酸乙酯超声振荡3次，每次2 mL，倾去乙酸乙酯，挥干，1.5 mL 75%甲醇复溶，12000 r·min-1离心 10 min，取上清液即为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液精密称取具栖冬青苷和毛冬青酸对照品适量，加甲醇定容，摇匀，分别制成每1 mL含具栖冬青苷5.75 mg、含毛冬青酸5.64 mg的对照品储备液，备用。另精密移取各储备液适量，制成质量浓度分别为 4.31 mg·mL-1、4.23 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 线性关系考察

精密吸取“2.2.2”项下的混合对照品溶液适量，倍比稀释成6个不同浓度的混合对照品溶液，各取20 μL进行HPLC法测定。以各成分的峰面积（A）为纵坐标，进样浓度（C）为横坐标进行线性回归，分别得标准曲线方程及线性范围：A具栖冬青苷=4.5058C+62.702 （r=0.9995），1.22～521.1 μg·mL-1；A毛冬青酸=6.9937C+135.51（r=0.9991），1.23～289.6 μg·mL-1。

2.4 精密度试验

精密移取具栖冬青苷和毛冬青酸混合对照品溶液20 μL，在上述色谱条件下，重复进样6次，记录峰面积，结果表明具栖冬青苷、毛冬青酸的RSD分别为0.04%、0.03%。

精密称取2.25 g毛冬青胶囊（批号130401），按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，记录峰面积，结果表明，具栖冬青苷、毛冬青酸的RSD分别为0.72%、1.52%。

2.5 重复性试验

精密称取2.25 g毛冬青胶囊（批号130401），按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，平行操作6份，在上述色谱条件下，测得具栖冬青苷和毛冬青酸的平均质量浓度分别为 570.7 μg·mL-1和 316.6 μg·mL-1，RSD分别为1.82%和1.06%。

2.6 稳定性试验

取毛冬青胶囊，依“2.2.1”项方法制备供试品溶液，室温放置，分别于 0、4、8、10、24 h 按“2.1”项下色谱条件分析。测得具栖冬青苷和毛冬青酸的RSD分别为1.16%和0.96%。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的供试品溶液0.5 mL，分别加入适量的具栖冬青苷和毛冬青酸对照品储备液，按“2.2.1”项方法制备供试品溶液，平行操作6份，HPLC法检测各成分的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.8 含量测定

按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，测定3个批次毛冬青胶囊中具栖冬青苷和毛冬青酸的含量，见表2。

表2 3个批次毛冬青胶囊中2种活性成分的含量（n=3）

3 讨 论

3.1 毛冬青胶囊所含成分较多，且含有制剂辅料，样品前处理较为困难。本实验分别考察了甲醇提取、乙酸乙酯提取和固相小柱萃取，结果采用甲醇提取，乙酸乙酯萃取（弃去，预试验时测不到具栖冬青苷和毛冬青酸），75%甲醇复溶后分析结果较为满意。

3.2 毛冬青胶囊所含成分复杂，极性差异较大，等度洗脱很难分离，经色谱条件优化，选择梯度洗脱。赖珊等[4]采用乙腈-0.05%磷酸溶液系统梯度洗脱法，进行了毛冬青注射液HPLC指纹图谱研究。李超生等[5]以60%甲醇为流动相，HPLC法测定救必应药材中具栖冬青苷的含量。参考文献色谱条件，进行优化，采用甲醇-磷酸溶液系统梯度洗脱法，所得峰形对称且分离较好。

3.3 经全波长扫描发现，具栖冬青苷和毛冬青酸波长为210～215 nm时所测成分响应较好，考虑溶剂响应的影响，选择215 nm为检测波长。

3.4 实验结果表明，不同批次毛冬青胶囊中具栖冬青苷和毛冬青酸的含量相近，说明其原料质量和生产工艺较稳定。此测定方法简便、准确、重复性好，可为完善毛冬青胶囊质量控制提供参考。

[1] 江苏新医学院.中医药大辞典（上册）[M].上海：上海人民出版社，1977：441-3.

[2] 蔡 雄，刘中秋，祝晨蔯，等.毛冬青化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 广东药学，2001，11（1）：4-6.

[3] 熊友香，李 昶，罗宪堂.毛冬青的化学成分药理作用研究进展[J]. 中药材，2002，25（5）：371-4.

[4] 赖 珊，杨立伟，欧国灯，等.毛冬青注射液HPLC指纹图谱研究[J]. 中药材，2009，32（7）：1132-4.

[5] 李超生，张 婷，李林国，等.高效液相色谱法测定救必应药材中具栖冬青苷的含量[J].特产研究，2007，29（4）：45-7.