响应曲面优化枇杷叶绿原酸超声微波提取工艺

唐纯翼，吴显明

1吉首大学城乡资源与规划学院，张家界427000;2吉首大学化学化工学院，吉首416000

枇杷叶，蔷薇科植物枇杷［Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl．］的干燥叶，别名巴叶、芦桔叶，传统中药，性微寒，味苦辛，归肺、胃经，具有清肺止咳，降逆止呕等功效。药理研究表明枇杷叶具有较好的抗炎和止咳作用，近年研究还发现，枇杷叶有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、保肝利胆、清除氧自由基、增强机体免疫功能等作用［1］。

绿原酸具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、降血压、延缓衰老作用及兴奋中枢神经系统等［2，3］，广泛用于食品保鲜剂、食品添加剂、植物生长激素及一些高级化妆品的添加剂等，是食品、药品、化妆品等工业的重要原料［4］。

响应面法(RSM)是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程进行分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种用于开发、改进、优化的统计和数学方法。Box-Behnken实验设计法是响应面法的一种，它可以提供3到10个因素，进行低、中、高三水平的的二阶实验设计，评价因素和指标间的非线性关系［5，6］。

绿原酸的提取方法有水提法、醇提法、微波提取法、超声波提取法等，都是单一提取方法且提取率均偏低。本研究以枇杷叶原料，采用超声波和微波协同技术提出绿原酸，应用Box-Behnken实验设计法研究相关因素对提取率的影响，筛选出最佳的提取工艺参数，以期为枇杷叶中绿原酸的提取提供借鉴。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

枇杷叶－，2012年3月采自张家界(洗净，40℃恒温干燥至恒重，粉碎过80目筛);绿原酸标准品－，中国药品生物制品检定所;无水乙醇为分析纯;蒸馏水为自制。

1．2 仪器与设备

SK3200H型超声波清洗器－，上海垒固仪器有限公司;SF8213型医药不锈钢粉碎机－，上海科太粉碎设备厂;TDZ5-WS型台式离心机－，赛特湘仪离心机仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅－，常州国华有限公司;UV-160A型紫外-可见分光光度计、AUY120型电子天平－，日本岛津公司;改制格兰仕微波炉－，格兰仕电器实业公司。

1．3 实验方法

1．3．1 标准曲线绘制

称取绿原酸标准品10 mg，无水乙醇溶解并定容至 1000 mL。分别吸取 0．0、1．0、2．0、3．0、5．0、6.0 mL，无水乙醇定容25 mL。用1 cm比色皿，无水乙醇为空白，在329nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标、绿原酸质量分数为横坐标绘制标准曲线，得回归方程:y=0．0383x+0．123，相关系数R2=0．9991。

1．3．2 枇杷叶绿原酸提取及提取率计算

称取样品2．0 g于250 mL锥形瓶中，70%乙醇浸泡12 h，在50℃、200W条件下超声30 min，再在400W条件下微波辐射回流5 min，将提取物冷却、过滤，测定提取液吸光度，由标准曲线计算绿原酸含量，由下式计算提取率［7］。

绿原酸提取率/%=(C×n×V)/(m×106)×100

式中:C为通过标准曲线计算出的绿原酸质量浓度(μg/mL);n为稀释倍数;V为配成溶液体积(mL);m为样品的质量(g)。

1．3．3 单因素试验

在料液比1∶15(g/mL)、超声功率200 W、超声温度50℃、超声时间30 min、微波功率400W、微波时间5 min等基本工艺条件下，考察乙醇体积分数、料液比、微波功率、微波时间对绿原酸提取率的影响。

1．3．4 响应曲面法试验

选取4因素3水平，以绿原酸提取率为响应值，运用 Design Expert建立的中心组合试验 Box-Benhnken设计方案进行优化。4因素为乙醇体积分数(X1)、料液比(X2)、微波功率(X3)、微波时间(X4)，3 水平为低(-1)、中(0)、高(+1)。

2 结果与分析

2．1 单因素试验

2．1．1 乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响

图1 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

图1显示，随着乙醇体积分数增大，绿原酸提取率逐渐升高，70%乙醇时最高，之后随乙醇体积分数增大而降低。这是因为乙醇体积分数过大时，乙醇分子间的结合力高于乙醇分子与绿原酸分子间的结合力，绿原酸溶出率反而下降，故选择乙醇体积分数70%。

2．1．2 超声温度对绿原酸提取率的影响

图2 超声温度对绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of chlorogenic acid

图2显示，温度升高，绿原酸提取率上升，原因是温度升高绿原酸溶解度增大。至50℃时达最大值，随后温度升高绿原酸的提取率开始下降，原因是绿原酸分子的邻二酚羟基高温时易被氧化，以及高温时不利于形成超声波微射流对细胞表面产生冲击、剪切时所需要的高密度与强压梯度气泡，从而使绿原酸溶解度下降。因此，选择50℃为适宜提取温度。

2．1．3 料液比对绿原酸提取率的影响

图3 料液比对绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of sample-to-solvent ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

图3显示，料液比的降低，绿原酸提取率上升，原因是料液比降低加大了提取过程的传质推动力。至1∶15(g/mL)时，绿原酸提取率达到了最大，之后料液比降低提取率反而下降，原因是料液比过小使溶剂升高到相同的温度所需要的时间变长，从而降低了提取率。

2．1．4 微波功率对绿原酸提取率的影响

图4 微波功率对绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect ofmicrowave power on the extraction yield of chlorogenic acid

图4显示，微波功率增大，绿原酸提取率随之增大，原因是功率增大体系温度升高，绿原酸溶解度增大。至400 W时，提取率达到最大，之后绿原酸提取率随功率加大反而下降，原因是微波功率增大导致温度升高，绿原酸分子的邻二酚羟基结构被氧化分解而使提溶解度下降。考虑到离子溶液吸收微波的能力较强，小功率即可将样品中的绿原酸萃取完全，功率过大使绿原酸降解以及成本问题，选择提取功率400W。

2．1．5 微波辐射时间对绿原酸提取率的影响

图5 微波辐射时间对绿原酸提取率的影响Fig.5 Effect ofmicrowave irradiation time on the extraction yield ofchlorogenic acid

图5显示，提取率随微波辐射时间延长而升高，原因是提取液温度随微波辐射时间延长而升高导致绿原酸溶解度增加。至5 min达到最大值，之后提取率随微波辐射时间延长反而下降，原因是过高的温度使提取液爆沸而与样品的有效接触时间减少，故辐射时间取5 min较适宜。

2．2 响应面分析

2．2．1 中心组合试验Box-Behnken方案设计的因素及水平编码

表1 中心组合试验Box-Behnken方案设计的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnkencenter-composite experimental design

2．2．2 Box-Behnken设计方案及试验结果

表2 Box-Behnken设计方案及试验结果Table 2 Box-Behnken design matrix and extraction vieldofchlorogenic acid

3-1 +1 0 0 5．79 5．84 4+1 +1 0 0 5．83 5．84 5 0 0-1 -1 5．85 5．81 6+1 -1 5．81 5．82 7 0 0-1 +1 5．84 5．87 0 0+1 +1 5．48 5．40 9-1 0 0 -1 5．77 5．66 10 +1 0 0 -1 5．53 5．46 11 -1 0 0 +1 5．43 5．54 12 +1 0 0 +1 5．84 5．84 13 0 -1 -1 0 5．54 5．51 14 0 +1 -1 0 5．77 5．69 15 0 -1 +1 0 5．75 5．85 16 0 +1 +1 0 5．69 5．52 17 -1 0 -1 0 5．48 5．49 18 +1 0 -1 0 5．43 5．52 19 -1 0 +1 0 5．67 5．66 20 +1 0 +1 0 5．47 5．54 21 0 -1 0 -1 5．44 5．48 22 0 +1 0 -1 5．85 5．84 23 0 -1 0 +1 5．62 5．64 24 0 +1 0 +1 5．86 5．84 25 0 0 0 0 5．46 5．55 26 0 0 0 0 5．33 5．38 27 0 0 0 0 5．74 5．61 28 0 0 0 0 5．64 5．66 8 0 0 29 0 0 0 0 5．41 5．53

2．2．3 二次回归模型建立

利用Design Expert7．0软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得枇杷叶绿原酸提取率(Y)对乙醇体积分数(X1)、料液比(X2)、微波功率(X3)、微波时间(X4)的二次多项回归模型方程为:

Y=5．84+0．061X1+0．04 X2+0．12X3+0.035X4+0．11 X1X2+0．12 X1X3+0．12X1X4+0.12 X2X3-0．013 X2X4+0．02X3X4-0．11X21-0.11X32-0．15X23-0．09 X24，相关系数 R2=0．9450。

2．2．4 显著性检验

模型显著性检验结果见表3，回归模型系数显著性检验结果见表4。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomialmodel

表3显示，该模型方程具有极显著性(P＜0.01)，失拟差不显著(P＞0．05)，表明无失拟因素存在，对模型有利，可用于枇杷叶中绿原酸提取率的预测与分析。

表4 回归模型系数的显著性检验结果Table 4 Testing results of significancefor regression coefficient

表4显示，模型一次项X1、X2、X4对Y影响显著，X3对 Y 影响极显著;二次项影响显著不具显著性影响;交互项 X1X2、X1X3、X1X4、X2X3影响显著，X2X4、X3X4不具显著性影响。

2．2．5 响应曲面分析与优化条件的确定

根据回归分析结果作出 X1、X2、X3、X4及其交互作用对响应值的影响(图6～11)。响应曲面平面投影的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

图6 微波功率和料液比对提取率的影响Fig.6 Effects of microwave power and solidsample-to-solvent ratio on the extraction yield

图7 微波时间和微波功率对提取率的影响Fig.7 Effects ofmicrowave power andmicrowavetime on the extraction yield

图8 料液比和乙醇体积分数对提取率的影响Fig.8 Effects of ethanol concentration and sample-to-solvent ratio on the extraction yield

图9 微波时间和乙醇体积分数对提取率的影响Fig.9 Effects of ethanol concentration andmicrowavetime on the extraction yield

图10 微波功率和乙醇体积分数对提取率的影响Fig.10 Effects ofmicrowave power and ethanol concentration on the extraction yield

图11 微波时间和料液比对提取率的影响Fig.11 Effects ofmicrowavetime and sample-to-solvent ratio on the extraction yield

由图6～11可知，4因素间均有较明显的交互作用。依据软件给出的工艺条件，考虑成本、实际操作需要等因素后修订的最佳工艺条件为:微波功率400 W、溶剂乙醇体积分数70%、料液比1∶15(g/mL)、辐射时间5 min。此条件下实验得到平均提取率为 5．85%，平均回收率为 97．4%，RSD为4.04%，比理论平均提取率5．65%高0．20%，所以基于响应曲面法所得的优化提取工艺数据准确可靠。

3 结论

RSM法优化后的枇杷叶中绿原酸超声波微波协同提取最佳工艺为:枇杷叶粒度80目，预浸泡12 h，料液比1∶15(g/mL)、乙醇体积分数70%、50 ℃超声30 min、微波功率400 W、微波时间5 min。本试验条件下枇杷叶绿原酸提取率达到5．84 g/mg。枇杷叶中其它活性成分如黄酮类物质对于绿原酸提取是否干扰，以及梯次提出枇杷叶中主要活性成分，还有待进一步研究。

1 Guo Y(郭宇)，Wu SJ(吴松吉)，Piao HS(朴惠善)．Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities of Eriobotrya japonica leaves．Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2006，17:928-930．

2 Wang JH(王建辉)，Liu YL(刘永乐)，Li CX(李赤翎)，et al．Effect of chlorogenicacid extracted from Eucommiaulmoides Oliv．on hemorheologicalchanges of mice induced by high fat diet．Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2012，24:1186-1190．

3 TracyL，Farrell TP，Dew LP，etal．Absorption andmetabolism of chlorogenic acids in cultured gastric epithelial monolayers．Drug Metabol Dispos，2011，39:2338-2346．

4 Xiao HY(肖怀秋)，Li YL(李玉珍)，Lan LX(兰立新)．Studies on extraction technology of cholorogenicacid from FlosLoniceraeusing ethyacetate assisted by ultrasonic．Food Ferment Technol(食品与发酵科技)，2009，5(2):48-50．

5 Zhang M(张冕)，Wang DT(王德堂)，Liu E(刘娥)．Optimization of thymopentin liposome formulation by Box-Behnken experimental design．Chin J Biochem Pharm(中国生化药物杂志)，2012，33:808-810．

6 Wu GJ(吴光杰)，Li YP(李玉萍)，Pi XF(皮小芳)，et al．Optimization of polysaccharides extraction process from Portulaceoleracea L．by response surfacemethodology．Food Machine(食品与机械)，2010，26:129-133．

7 Xiao ZB(肖卓炳)，Guo RK(郭瑞轲)，Guo MM(郭满满)，etal．Optimization of ultrasonic-microwave assisted extraction of chlorogenicacid from FlosLonicerae．Food Sci(食品科学)，2012，33:111-114．