降解菜籽饼粗蛋白耐盐菌的筛选、鉴定及固体发酵的初步研究

吴民熙，刘清术，刘前刚，单世平

湖南省微生物研究所，长沙 410009

中国油菜资源十分丰富，其榨油后副产物菜籽饼粕年产量约为800万吨［1］，菜籽饼粕是一种优良的有机肥料，蛋白质含量高，富含氮、磷、有机质，特别是对烟草的肥效优于普通有机肥，在烟田间直接施用菜籽饼粕，可改善烟田土壤结构，增加温度促进微生物活动以及保蓄养分［2-6］，还有研究表明，配施不同形态菜籽饼肥的烟草，以施菜籽饼肥滤渣处理增加烤烟主要挥发性香气物质方面效果明显，其新植二烯、类胡萝卜素降解物、类西柏烷化合物、美拉德反应物、芳香族氨基酸降解物以及非新植二烯中性香气物的含量最高［6］，但自然降解速度极慢，且肥效不易发挥。目前，大量试验证明，利用微生物发酵将菜籽粕中蛋白质等大分子降解后，制成烟草专用生物有机肥施入烟田，有利于烟草合成较多的蛋白质，促进细胞的合成和植株中香气物质的积累，从而形成较好的产量和品质［7-9］。而长期以来，烟草专用生物有机肥研究过程中，功能菌一直存在着保质期不够长的问题，这主要是专用肥中高盐环境影响了功能菌存活率。本研究将自制的含菜籽饼烟草专用生物有机肥的堆肥，露天堆肥腐熟10 d后，取6.8 kg置于20 L的塑料桶内，盖好顶盖，保存6个月后，从发酵样品中筛选得到3株能以菜籽饼为原料生长且具备较高耐盐能力的菌株A2、A4、A7，并初步摸索和探讨其在灭菌条件下单一菌株对菜籽饼的降解能力。所筛选的3株耐盐菌株，为今后研制含菜籽饼的烟草专用生物有机肥延长保质期提供了有利保证。

1 材料与方法

1.1 材料

市购菜籽饼:棕色，呈颗粒状，将菜籽粕于70℃下烘干，粉碎40目过筛备用。烟草专用生物有机肥为湖南省微生物研究所植保组研制。

1.2 培养基

酪蛋白培养基:酪蛋白2%，用NaOH加热湿润，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)定容至100 mL;完全培养基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl 1%、琼脂1.5%，pH 7.2～7.5;液体发酵培养基:淀粉1.0%、菜籽饼 6%、MgSO4·7H2O 0.04%、KH2PO40.15%，pH 7.2～7.5。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的筛选

1.3.1.1 高产蛋白酶菌种初筛

取保存6个月生物有机肥样品5 g，混于100 mL无菌水，取1 mL，稀释1000倍，均匀涂布到酪蛋白培养基上，30℃恒温培养24～48 h后观察，测菌落直径(d，mm)和水解圈直径(D，mm)，采用DP表示水解能力:DP=D-d。在酪蛋白培养基上挑取DP较大的菌落，再经过四分区划线，挑得单一菌落后保存。

1.3.1.2 高产蛋白酶菌种复筛

将分离纯化的菌接入液体发酵培养基中，30℃，170 rpm培养24 h，用以测定蛋白酶活力。以10%的接种量到菜籽粕液体发酵培养基中发酵48 h后，将发酵液用离心机4000 rpm，离心10 min，取上清液1 mL，稀释20倍，用福林法测定。

1.3.1.3 耐盐菌的筛选

所筛高产蛋白酶的菌种接入液体完全培养基中，30℃下恒温培养分别转接到含5%、10%、15%、20%、25%NaCl的固体完全培养基上划线，30℃下培养3 d，观察生长情况，以确定细菌耐盐程度［10］。

1.3.1.4 单一菌种发酵菜籽饼的初步摸索

将培养好的3个菌种的发酵液按接种量10%分别接入装有已灭菌的100 g菜籽饼具棉花塞的500 mL锥形瓶中，放入35℃恒温箱进行固体发酵，每天上下翻动数次，发酵5 d后用分别测定各个发酵样品中粗蛋白、游离氨基酸、粗纤维、总糖、粗脂肪、灰分含量，发酵10 d后测定各个发酵样品中的粗蛋白、游离氨基酸含量。

1.4 分析方法

1.4.1 蛋白酶活力

采用福林法测定。

1.4.2 发酵物中粗蛋白含量

取发酵物少许，125℃过夜烘干，碾磨成粉末状，称取0.4 g，加50 mL蒸馏水煮沸5 min，50℃下水浴保温30 min，加10 mL 6%硫酸铜溶液，静置过夜，过滤收集沉淀，用凯氏定氮法测定蛋白氮含量(硝化连同滤纸一起放人凯氏瓶内硝化)。

粗蛋白含量=蛋白氮含量×6.25

1.4.3 其他物质含量的测定

游离氨基酸含量，利用茚三酮法测定;总糖含量，蒽酮比色测定;粗纤维含量，采用酸碱法测定;粗纤维含量，用酸碱法测定;粗脂肪含量，用油重法测定;灰分含量，用灼烧法测定。

蛋白质降解率(%)=［(发酵前蛋白质含量-发酵后蛋白质含量)/发酵前蛋白质含量］×100

1.4.4 16SrDNA分子水平菌种鉴定

根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物27F和1492R。

2 结果与讨论

2.1 菌种的筛选及菌种产蛋白酶活性的测定

利用酪蛋白培养基初筛出DP均大于8 mm的9个菌株 A1～A9，如图1所示。

图1 菌种水解酪蛋白情况Fig.1 Effect of different strains on hydrolysis of casein

再通过将所筛菌种接入液体完全培养基30℃恒温培养，菌液用福林法测定蛋白酶活力，如图2所示。

图2 不同菌种液体培养产蛋白酶活力ig.2 Effect of different hydroponic strains on protease activity

2.2 耐盐性菌种的筛选与单一菌种对菜籽饼降解程度的测定

由于菌种在固体和液体培养基中生长的耐盐性表现可能不同，所以将所挑选蛋白酶活力较高的菌株 A2、A4、A6、A7，分离纯化后，分别转接到含 5%、10%、15%、20%、25%NaCl的固体和液体完全培养基中培养。固体完全培养基划线，30℃下培养3 d，观察生长情况，以确定细菌耐盐程度;液体完全培养基以培养好的菌液稀释5倍并以空白培养液(稀释5倍)为对照，采用UV-1600分光光度计，在波长为600 nm下测定菌液的光密度。每一组菌液重复测量3次，取平均值。固体培养基生长情况如表1所示。

表1 耐盐菌种在含盐平板上生长情况Table 1 Result of salt-tolerant bacteria growth on salt flat

液体完全培养基生长情况如表2，NaCl含量5%、10%、15%、20%、25%的摇瓶培养72 h后观察，每个菌种做3个平行，结果如表2所示。

表2 菌种 A2、A4、A6、A7耐盐性试验结果Table 2 Effect of NaCl concentrations on strains A2，A4，A6 and A7

A6在含5%、10%NaCl的完全培养基中生长缓慢，耐盐程度不高予以淘汰，A2、A4、A7在含5%、10%NaCl的完全培养基中生长良好。经传代10次以上后在10%NaCl的完全培养基能生长，说明此3种菌株的耐盐性在遗传上具有稳定性，因此可作耐盐菌予以保留并进行菌种鉴定。

2.3 菌种的鉴定

2.3.1 形态观察

经过稀释平板法观察到菌株菌落乳白色，表面湿润光滑，边缘呈发射分支状，在油镜下观察，菌株A2、A4、A7经过12 h培养后细菌呈直杆状，革兰氏染色为阳性，48 h后细菌呈椭圆状，革兰氏染色为阴性，有芽孢，A2、A4芽孢呈卵圆，A7呈椭圆状。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌鉴定手册》初步确定为芽孢杆菌属。

2.3.2 16S rDNA序列分析及系统发育分析

对3菌株进行总DNA提取，PCR获得16S rDNA基因交由生物公司测序，分别获得菌株A2、A4、A7长度为1457、1460、1464 bp核苷酸序列。利用MEGA5.1软件与NCBI数据库中的DNA序列进行比对，并构建系统发育进化树(图3～5)。结果表明，A2菌与解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42)的同源性最高，为96%，初步鉴定其为解淀粉芽孢杆菌。A4菌与解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42)的同源性最高，为88%，初步鉴定其为解淀粉芽孢杆菌，A7菌与栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius strain 110)的同源性最高，为100%，初步鉴定其为栗褐芽孢杆菌。

图3 菌株A2的16S rDNA系统发育树Fig.3 Phylogenetic analysis of strain A2based on 16S rDNA gene sequence

图4 菌株A4的16S rDNA系统发育树Fig.4 Phylogenetic analysis of strain A4based on 16S rDNA gene sequence

图5 菌株A7的16S rDNA系统发育树Fig.5 Phylogenetic analysis of strain A7based on 16S rDNA gene sequence

2.3.3 生理生化指标测定

根据相关文献［18］及《常见细菌鉴定手册》中芽孢杆菌属中各个种的特征，结合以上检测到的生理生化特性及16S rDNA序列分析可以确定:A2和A4为解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain);A7为栗褐芽孢杆菌菌株(Bacillus badius strain)。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Characteristics of strains A2，A4，A7in different physiological or biochemical reaction

2.4 单一菌种发酵降解菜籽饼的测定

以未发酵的菜籽饼粕作对照，经检测，粗蛋白含量为37.72%，游离氨基酸态氮含量为0.78%，粗纤维含量为24.72%，粗脂肪含量为6.08%，灰分为3.97%，总糖含量为1.68%，将本实验室筛选的3株菌种分别接种到已灭菌的菜籽饼中，发酵后5 d分别测定菜籽饼中粗蛋白、游离氨基酸、粗脂肪、粗纤维、灰分、总糖等含量，结果如下见图6。

图6 单一菌种发酵降解菜籽饼效果(第5 d)Fig.6 Fermentation result of single fungus in rapeseed cake(the 5thday)

由于菜籽饼中粗蛋白含量较高，在微生物分解作用下，粗蛋白被大幅度降解，分解成小肽和氨基酸，决定微生物降解菜籽饼能力的重要指标是粗蛋白的含量和游离态氨基酸的含量，因此，我们选定第10d主要测定粗蛋白和游离氨基酸这两个指标，结果见图7。

图7 单一菌种发酵降解菜籽饼效果(第10 d)Fig.7 Fermentation result of single fungus in rapeseed cake(the 10thday)

三菌株都是接入已灭菌的菜籽饼中，生长状况更能体现单一菌种对基质的降解能力和适应性，根据测定数据可知，三个所筛选出的菌株在第5、10d对菜籽饼粗蛋白降解率最高的菌株都是A4，而A7最低，A4在第10d还达到17.6%，并且游离氨基酸含量达到1.54%，可能说明该解淀粉芽孢杆菌菌株A4在含硫代葡萄甙即芥子甙的菜籽饼中适应能力比栗褐芽孢杆菌菌株A7强，而A2与A7菜籽饼粗蛋白降解率相近，A4与A7降解粗脂肪能力相似，这可能说明该同属芽孢杆菌的不同种菌株降解菜籽饼粗蛋白、粗脂肪能力相当;A2、A4降解粗纤维的能力低于A7，这可能说明该同种的芽孢杆菌不同菌株降解菜籽饼粗纤维能力不同。

3 结论及展望

试验筛选出三种细菌，经鉴定A2、A4为解淀粉芽孢杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens strain);A7为栗褐芽孢杆菌菌株(Bacillus badius strain)，其中，栗褐芽孢杆菌菌株能产生有机酸，对土壤中不溶性的无机磷具有较好降解能力，可作土壤溶磷菌肥的组成菌种;解淀粉芽孢杆菌菌株在含硫代葡萄甙即芥子甙的菜籽饼中有较强的生存能力，能分泌高活性的胞外酶系，具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，其胞外酶可以降解某些复杂的植物性碳水化合物如羧甲基纤维素、粗脂肪、淀粉等，而在本研究中所选育解淀粉芽孢杆菌和栗褐芽孢杆菌对菜籽饼粗蛋白均表现出较强的降解能力，解淀粉芽孢杆菌还表现出对菜籽饼液化能力，因此，对所得三个菌株的产蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶等酶的活性有待于进一步的研究，其耐盐及分解菜籽饼能力正在进一步的开发中，据近期报道，解淀粉芽孢杆菌可以改善作物根际环境促进作物生长及耐盐能力［12］，因而具有很好的研究和应用前景，这些研究都为利用菜籽饼生产烟草专用生物有机肥打下基础。

1 Yu GP(于国平).China’s rapeseed，rapeseed oil and rapeseed meal price trend analysis in 2008.Grain Iss Res(粮食问题研究)，2008，3:21-23.

2 Cao ZH(曹志洪).Soil and fertilization of high-quality fluecured tobacco production(优质烤烟的生产与施肥).Nanjing:Jiangsu Science and Technology Press(江苏科学技术出版社)，1995.

3 Li GC(李广才)，Li FX(李富欣)，Wang LH(王留河).The effects of humic acid and cake on soil nutrition and growth of flue-cured tobacco.Tobacco Sci Technol(烟草科技)，1999，3:39-41.

4 Ogoshi A.PGPR-Present status＆future prospects.Sapporo Japan，1997，73-321.

5 Halder AK.Solubilization of inorganic phosphate by rhizobium.Folia Microbial，1993，38:325-330.

6 Qiu X(邱鑫)，Xiao HQ(肖汉乾)，Xiang TY(向天勇)，et al.Screening，identification and study of fermentation condition of the crude protein-degradation stain in rape cake.China Biotechnol(中国生物工程杂志)，2005，Suppl:303-307.

7 Li J(黎娟)，Zhou QM(周清明)，Liu X(刘逊)，et al.Effect of application of different forms of rapeseedcake fertilizerson volatile aroma content of tobacco.Crop Res(作物研究)，2011，25:336-339.

8 Wang JY(王静雅)，Zeng C(曾炽)，Wu YY(吴永尧)，et al.Solid state fermentation of rapeseed meal with mixture strains.Hunan Agric Sci(湖南农业科学)，2011，7:14-17.

9 Li J(李季).Practical Handbook of Composting Project(堆肥工程实用手册).Beijing:Chemical Industry Press(化学工业出版社)，2005.1-7.

10 Zhou YG(周钰钢)，Wei W(魏巍).Isolation and identification of a strain of salt-tolerant bacillus sp..J Univ Sci Technoy Beijing(北京科技大学学报)，2007，Suppl:221-222.

11 Yan YN(颜焱娜)，Liu RP(刘仁萍)，Wu YY(吴永尧)，et al.Solation of strains degrains degrading the garbage of oil and fat.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2010，22:674-677.

12 Nautiyal CS，Srivastava S，Chauhan PS，et al.Plant growthpromoting bacteria Bacillus amyloliquefaciens NBRISN13 modulates gene expression profile of leaf and rhizosphere community in rice during salt stress.Plant Physiol Biochem，2013，66:1-9.