甲基京尼平差向异构体的拆分与结构确证

王美瑜，邹茜茜，刘 珂，许 卉，范华英，车 鑫

烟台大学药学院，烟台 264005

栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jaminoides Ellis)的干燥成熟果实。其性味苦，寒，归心、肺、三焦经［1］。具有保肝利胆［2］、保护神经细胞［3］、抗抑郁［4］、抗炎［5］、抗肿瘤［6］、降血糖［7］、抗氧化、抗高血压、抗血栓以及抗骨质疏松［8］等作用。栀子果实的化学成分很多，主要包括藏红花素类、环烯醚萜类、有机酸等［9］，其中环烯醚萜类的活性最高的成分为京尼平苷［10］。京尼平苷是一种单环环烯醚萜苷类化合物，无毒，易溶于水。《伤寒论》中记载的栀子豉汤，主治“心烦不得眠，心中懊恼”，现代研究证实其中的京尼平苷具有明显的抗抑郁作用［11］。但有文献报道，大剂量应用京尼平苷可导致明显的肝、肾病理学改变，京尼平苷是栀子肝、肾毒性的主要物质基础。京尼平苷产生毒性的原因是其在肠道内细菌的作用下水解成京尼平，京尼平与体内氨基酸结合生成具有较强生物活性的栀子蓝，栀子蓝可能为其导致肝肾毒性的直接物质基础［12，13］。

为寻找化学和代谢稳定性良好、生物利用度高、毒性较小的新型京尼平衍生物。本课题合成了新型京尼平衍生物:甲基京尼平，并发现甲基京尼平的肝毒性明显小于京尼平苷。甲基京尼平是在京尼平苷的基础上甲基化制备而得，在反应的同时发现甲基京尼平为一对异构体的混合物，同时含有R、S-甲基京尼平(图1)。本实验经过制备型高效液相色谱同时分离得到R、S-甲基京尼平，为药效的研究提供物质基础。

图1 R-甲基京尼平(A)及S-甲基京尼平(B)的化学结构Fig.1 Chemical structures of R，S-methyl genipin

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪、岛津SIL-20A自动进样器(日本岛津);R205旋转蒸发仪(上海禾汽玻璃仪器有限公司);varian210制备型高效液相色谱(美国varian);岛津UV-2550紫外光谱测定仪(日本岛津);Bruker AV400 MHz核磁共振仪(以 TMS为内标)(美国布鲁克);Diamonsil C18反相液相色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，中国迪马公司)、Waters Bondapak C18色谱柱(19 mm ×200 mm，20 μm)。

1.2 试药

京尼平苷(购自四川泰康有限公司，含量 ＞95%);甲醇(色谱纯，Oceanpak)，无水甲醇(分析纯，天津市福晨化学试剂厂);浓硫酸(分析纯，烟台市双双化工有限公司);石油醚(分析纯，天津市化学试剂一厂);乙酸乙酯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);氯仿(分析纯，天津市福晨化学试剂厂);水(市售纯净水)。

2 实验方法

2.1 甲基京尼平的合成

取1.0 g京尼平苷于50 mL圆底烧瓶中，量取1 mol/L硫酸-甲醇10.0 mL，65℃加热回流4 h。用NaOH中和以后减压蒸去溶剂，加水、氯仿(1∶2)萃取3次，氯仿层蒸干溶剂后，硅胶柱层析采用石油醚、乙酸乙酯梯度洗脱分离得到甲基京尼平，其1H NMR数据与文献报道一致［14］，结果见表1。液相验证纯度时发现产物为一对异构体的混合物(见图2)。

图2 甲基京尼平HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of methyl genipin A:R-甲基京尼平;B:S-甲基京尼平A:R-methyl genipin;B:S-methyl genipin

2.2 (R)-甲基京尼平、(S)-甲基京尼平的拆分

取上述方法制备得到的甲基京尼平加甲醇制成30 mg/mL的溶液作为供试品溶液，经制备型高效液相色谱分离，合并相同的馏分，50℃减压蒸干，得到化合物A 80 mg、化合物B 15 mg。制备液相的色谱条件如下:流动相为甲醇-水(15∶85)，流速为10.0 mL/min，检测波长为238 nm，进样量2 mL，柱温30℃。分析型液相验证条件如下:流动相为乙腈-水(25∶75)，流速为 1.0 mL/min，检测波长为 238nm，柱温30℃，进样量为20 μL。经验证化合物A和化合物B的纯度分别为98%、95%(见图3)，可以用于结构鉴定。

图3 纯化的R-甲基京尼平(A)及S-甲基京尼平(B)HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of purified R-methyl genipin(A)and S-methyl genipin(B)

3 结果与讨论

3.1 (R)-甲基京尼平、(S)-甲基京尼平、甲基京尼平的结构测定

以CDCl3为溶剂，在400 MHz的核磁下对化合物A和B进行了氢谱、NOESY谱测试。

化合物A 黄色油状固体，分析化合物A的1H NMR和NOESY谱数据，归属1H NMR信号(表1)，比较化合物A与甲基京尼平差向异构体的混合物的1H NMR，发现大部分氢信号一致，说明为甲基京尼平的差向异构体之一，结构中的1位绝对构型由NOESY决定，NOESY发现H-1位与H-5、H-9均不相关(见图4)，证明化合物A为R-甲基京尼平。

化合物B 黄色油状固体，分析化合物B的1H NMR和NOESY谱数据，归属1H NMR信号(表1)，比较化合物B与甲基京尼平差向异构体混合物的1H NMR，发现氢信号有部分不完全一致，认为可能是由于其在混合物中所占的比例小的缘故，但仍可以推测为甲基京尼平的差向异构体之一，结构中的1位绝对构型由NOESY谱决定，NOESY发现H-1位与H-5、H-9均有相关(见图4)，证明化合物B为S-甲基京尼平。

表1 R-甲基京尼平、S-甲基京尼平、甲基京尼平的1H NMR信号Table 1 1H NMR data of R-methyl genipin，S-methyl genipin and methyl genipin

图4 R-甲基京尼平(A)与S-甲基京尼平(B)的NOESY图谱Fig.4 NOESY spectra of R-methyl genipin(A)and S-methyl genipin(B)

3.2 讨论

由于S-甲基京尼平的含量较低，约为R-甲基京尼平的1/6，因此在拆分甲基京尼平的过程中，R-甲基京尼平易得到，而S-甲基京尼平不易获到纯度较高的单体。实验过程中先后考察了甲醇-水28∶72、25∶75、20∶80、15∶85，结果发现甲醇-水为 15∶85 时效果最佳，能够得到较好的分离。

4 结论

本实验成功地合成了甲基京尼平，并且采用制备型高效液相色谱，成功的分离得到了R、S-甲基京尼平，并对其结构进行了归属。

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