电子顺磁共振对五种中草药抗氧化活性的研究

周丽芳，朱 翔，赵红莉，蓝闽波，*，史新梅

1华东理工大学上海市功能性材料化学重点实验室;2华东理工大学分析测试中心，上海 200237

通常情况下，生物体在代谢的过程中不断地产生自由基，也有许多自由基中间体的参与，体内自由基的产生和消除在正常情况下始终保持着一种动态的平衡状态［1］。当环境有害因素诱导生物体体内活性氧自由基大量释放，大大超出了正常水平，就导致了机体的氧化应激状态，引起机体的氧化应激损伤［2］。而一些抗氧化剂能有效地清除生物体体内产生的过量的自由基，提高机体的抗氧化能力，降低氧化应激引起的脂质过氧化反应，有效地起到防止氧化损伤［3］。中草药是天然抗氧化剂，其抗氧化能力和中草药清除自由基的能力有关。本文主要利用电子顺磁共振技术研究比较了大黄等5种中草药对DPPH、·OH和的清除能力的大小，得到了抗氧化活性能力较强的中草药，为中草药用于生物体的抗氧化应激研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料:大黄、香青兰、香茅草、懈寄生和骆驼蓬子，购自上海雷允上药品连锁凌云店。

实验试剂:5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、二乙三胺五乙酸(DETAPAC)、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、黄嘌呤(X)和黄嘌呤氧化酶(XOD)均购自于Sigma公司;硫酸亚铁(Fe-SO4)购置于中国医药(集团)上海化学试剂公司;30%过氧化氢(H2O2)购置于金鹿化工有限公司;超纯水。

实验仪器:EMX-8/2.7电子顺磁共振波谱仪(德国Bruker公司);R201旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);Hitech-Sciencetool高端型超纯水机(上海和泰仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 中草药的提取

称量5 g中药，放置于250 mL的圆底烧瓶中，加入100 mL双蒸水，浸泡2 h，回流0.5 h，减压抽滤，再加入100 mL双蒸水，回流0.5 h，减压抽滤，第三次加入100 mL双蒸水，回流0.5 h，减压抽滤。合并3次滤液，减压旋蒸浓缩，定容于50 mL容量瓶中得到0.1 g/mL原药放置于4℃冰箱中待用。

1.2.2 中草药的抗氧化活性实验

1.2.2.1 中草药对DPPH的清除作用

量取不同浓度(8、6、4、2、1、0.5 mg/mL)的中药样品 50 μL，加入到100 μL 0.5 mmol/L 的 DPPH 溶液中，混合均匀后室温避光反应30 min，用微量注射器取上清液注入Teflon毛细管(直径1 mm，管壁0.1 mm厚，长度大约6 cm)中，将毛细管对折，插入顺磁石英样品管底部，将样品管插入谐振腔中心位置进行EPR常温检测。

实验参数:中心磁场:3513G;扫场宽度:150G;调制频率:100 KHz;调制幅度:1.5G;放大倍数:2.00e+004;扫描次数:1;微波功率:2.010 mW;时间常数:163.84 ms;扫场时间:41.943 s。

1.2.2.2 中草药对羟基自由基的清除作用

量取不同浓度(8、4、2、1、0.5 mg/mL)的中药样品 50 μL，加入 40 μL 0.2 mmol/L FeSO4的水溶液、40 μL 的双蒸水和 40 μL 0.1 mol/L DMPO 的水溶液，混合均匀后加入40 μL 0.1%H2O2，混合后立即取样，用微量注射器取上清液注入Teflon毛细管中，将毛细管对折，插入顺磁石英样品管底部，将样品管插入谐振腔中心位置进行EPR检测，整个过程控制在3 min内完成。

实验参数:中心磁场:3510 G;扫场宽度:100 G;调制频率:100 KHz;调制幅度:1.0 G;放大倍数:2.00e+004;扫描次数:1;微波功率:2.017 mW;时间常数:163.84 ms;扫场时间:41.943 s。

1.2.2.3 中草药对超氧阴离子自由基的清除作用

量取不同浓度(8、4、2、1、0.5 mg/mL)的中药样品50 μL，加入40 μL 0.5 mmol/L DETAPAC 的 PBS(pH7.8)溶液、40 μL 25 mmol/L X 的 PBS 溶液、80 μL 0.1 mol/L DMPO的水溶液，混合均匀后加入40 μL 0.25 u/mL XOD的PBS溶液，混合后立即取样，用微量注射器取上清液注入Teflon毛细管中，将毛细管对折，插入顺磁石英样品管底部，将样品管插入谐振腔中心位置进行EPR检测，整个过程控制在3min内完成。

实验参数:中心磁场:3513 G;扫场宽度:100 G;调制频率:100 KHz;调制幅度:1.0 G;放大倍数:5.64e+004;扫描次数:1;微波功率:20.12 mW;时间常数:163.84 ms;扫场时间:41.943 s。

1.2.3 实验数据处理

所有EPR实验均重复三次，以平均值表示，数据处理使用Origin 8.0，自由基清除率(radical scavenging activity)的计算公式为RSA=(H0-H)/H0×100%［4］，其中RSA为中药对自由基的清除率，H0为空白对照样特征峰的峰高，H为样品特征峰的峰高。

2 结果与讨论

2.1 中草药对DPPH的清除作用

DPPH自由基是一种稳定的自由基，可以直接在室温检测得到EPR信号，并且在短时间内不会发生衰减。利用电子顺磁共振法研究了不同浓度的大黄等五种中草药对DPPH自由基的清除能力。DPPH的EPR信号为五重峰，随着中草药浓度的升高而变小，DPPH峰形基本不变，只是高度发生了变化(图1以香茅草为例)。

图1 不同浓度的香茅草对DPPH的清除作用的EPR谱图Fig.1 EPR spectra of DPPH after adding different concentrations of lemongrass

根据DPPH清除率的计算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0为空白对照样中间峰的峰高，H为样品中间的峰高，可以得到5种中草药对DPPH自由基的清除率(表1)。

从表1可以看出，加入不同浓度的5种中草药对DPPH都有一定的清除作用，而且清除作用快，几分钟内就能清除大量的DPPH自由基，清除率和中药浓度呈现明显的量效关系，清除率随着中药浓度的增加而增加(图2以香茅草为例)，并且在一定的清除率范围内(一般为15% ～75%)呈现很好的线性相关［5］，清除率太高或太低的时候线性相关性下降。

表1 五种中药对DPPH的清除率Table 1 DPPH scavenging rates of five TCMs

图2 不同浓度的香茅草对DPPH的清除率随时间的变化曲线Fig.2 The DPPH radical scavenging rate-time curves of different concentrations of lemongrass

中草药清除DPPH自由基能力一般采用IC50表示，IC50的物理意义为中草药对DPPH自由基清除率达到50%时的质量浓度，IC50值越低，中草药清除自由基的能力越强。用Origin软件对中草药浓度和清除率进行多项式拟合，相关系数 R2匀大于0.9800，说明回归方程具有可靠性，能较好的解释中草药对DPPH自由基清除作用的剂量一效应关系。

由回归方程可以计算出5种中草药对DPPH自由基清除率为50%时所需的样品质量浓度IC50的值。5种中草药质量浓度和清除率的相关拟合方程，相关系数和IC50见表2。

表2 中草药对DPPH自由基清除作用的量效拟合方程Table 2 Dose-effect relationship simulated equations of the DPPH scavenging activity of TCMs

实验结果表明5种中草药对DPPH均有一定的清除作用，并且清除率随着中草药浓度的增加而增加，其中大黄、香茅草和香青兰对DPPH的清除作用较强，而大黄对DPPH的清除率更为显著，IC50＜0.5 mg/mL，懈寄生和骆驼蓬子的对DPPH的清除率较弱。

2.2 中草药对羟基自由基的清除作用

羟基自由基是一种短寿命的氧自由基，在水溶液中寿命只有10-6s，不能直接在室温检测得到EPR信号，必须加入自由基捕捉剂形成比较稳定的自由基加合物［6］。通过DMPO捕捉剂捕捉到的自由基加合物虽然比原有的羟基自由基稳定，但是也会发生衰减(图3)，因此实验加入DMPO捕捉剂后在3 min内完成EPR的检测。

图3 DMPO-OH的EPR强度随时间的变化曲线Fig.3 The changing curve of EPR intensity of DMPO-OH with time

本文利用电子自旋捕捉技术［7］，研究了5种中草药对通过Fenton反应产生的羟基自由基的清除能力。DMPO-OH的EPR信号为四重峰，强度比为1∶2∶2∶1，超精细耦合常数 aN=aH=14.9G。DMPOOH信号强度随着中草药浓度的升高而变小，而四重峰的峰形基本不变，只是高度发生了变化(图4以香茅草为例)。

根据羟基自由基清除率的计算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0为空白对照样第二个峰的峰高，H为样品第二个峰的峰高，可以得到5种中草药对·OH的清除率(表3)。

图4 不同浓度的香茅草对·OH的清除作用的EPR谱图Fig.4 EPR spectra of DMPO-OH after adding different concentrations of lemongrass

表3 五种中药对·OH的清除率Table 3 ·OH scavenging rate of five TCMs

用Origin软件对中草药浓度和清除率进行多项式拟合，得到5种中草药质量浓度和清除率的相关多项式拟合方程，相关系数和IC50见表4。

表4 中草药对·OH自由基清除作用的量效拟合方程Table 4 Dose-effect simulation equations of the·OH scavenging activity of TCM

实验结果表明5种中草药对·OH均有一定的清除作用，并且清除率随着中草药浓度的增加而增加，其中大黄和香茅草对·OH的清除作用较强，而大黄对·OH的清除率更为显著，IC50=1.892 mg/mL，骆驼蓬子对·OH的清除率较弱，IC50=7.189 mg/mL。

2.3 中药对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子自由基和羟基自由基一样也是一种短寿命氧自由基，不能直接在室温检测得到EPR信号，必须加入自由基捕捉剂形成较稳定的自由基加合物。本文利用电子自旋捕捉技术，研究了5种中草药对黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶体系反应产生的超氧阴离子自由基的清除能力，得到了DMPO-OOH的EPR谱图(图5以香茅草为例)，有12条谱线组成，超精细耦合常数 aN=14.3G=11.3G=1.4G。

图5 不同浓度的香茅草对的清除作用的EPR谱图Fig.5 EPR spectra of DMPO-OOH after adding different concentrations of lemongrass

根据超氧阴离子自由基清除率的计算公式，RSA=(H0-H)/H0×100%，H0为空白对照样第一个峰的峰高，H为样品第一个峰的峰高，可以得到不同中草药对的清除率(表5)。

表5 五种中药对的清除率Table 5 scavenging rate of five TCMs

表5 五种中药对的清除率Table 5 scavenging rate of five TCMs

样品浓度Sample concentration(mg/mL)8 6 4 2 1 0.5香青兰 D．moldavica L. 81.42 77.41 68.46 54.22 40.80 30.26香茅草Lemongrass 80.02 77.16 69.72 51.19 35.05 21.56懈寄生Mistletoe 77.75 71.24 61.41 41.96 26.11 18.03骆驼蓬子Deed of common peganum 80.61 72.91 67.31 57.04 50.97 44.57大黄Rhubarb 94.57 91.92 87.67 87.16 86.57 85.63

用Origin软件对中草药浓度和清除率进行多项式拟合，得到5种中草药质量浓度和清除率的相关多项式拟合方程，相关系数和IC50见表6。

表6 中草药对自由基清除作用的量效拟合方程Table 6 Dose-effect simulation equations of thescavenging activity of TCMs

表6 中草药对自由基清除作用的量效拟合方程Table 6 Dose-effect simulation equations of thescavenging activity of TCMs

样品Sample清除回归拟合曲线Simulation equation of dose and·OH scavenging activity相关系数R2 Correlation coefficient R2 IC50(mg/mL)香青兰D．moldavica L. y=25.52+15.02x-1.018x20.9846 1.866香茅草Lemongrass y=15.41+19.31x-1.426x2 0.9820 2.125懈寄生Mistletoe y=10.71+16.85x-1.073x2 0.9950 2.848骆驼蓬子Seed of common peganum y=42.63+7.443x-0.3496x2 0.9834 1.041大黄Rhubarb - - ＜0.5

2.4 讨论

我国的中草药是天然抗氧化剂的重要来源，从中药中筛选出抗氧化活性强的物质，用于生物体的抗氧化应激研究方面具有一定的应用价值。目前研究中草药抗氧化活性的方法有好几种，如勾明玥［8］等人采用DPPH分光光度法测定了26种植物的抗氧化活性，刘建华［9］等人采用DPPH和总抗氧化活性能力(FRAP)法对大黄蒽醌类化合物抗氧化活性的研究。中草药的抗氧化活性能力的大小主要表现为中草药清除自由基能力的大小，而电子顺磁共振方法是研究自由基最直接和最有效的方法和技术。本文采用了电子顺磁共振方法研究了大黄等5种中草药清除3种不同自由基的能力。实验结果表明大黄中草药对稳定自由基和活性氧自由基的清除作用最强，表现出较强的抗氧化活性能力。陈玉霞［10］等人用总抗氧化能力方法也研究过大黄等41种中草药的抗氧化活性能力表明大黄等一些中药具有较强的抗氧化作用。

3 结论

运用电子顺磁共振研究了大黄等5种中草药对DPPH、·OH 和三种自由基的清除作用，实验结果表明大黄等5种中草药对3种自由基均有一定的清除作用，其中大黄对3种自由基的清除率均为最大，大黄中草药的抗氧化活性能力较强，可应用于生物体的氧化应激研究，为中草药用于生物体的抗氧化应激研究提供依据。

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