黄连生物碱促小鼠睡眠实验研究

邹宗尧，王燕枝，胡慭然，夏 爽，王德珍，庞 婕，李学刚，2，3

（1.西南大学药学院，2.重庆市药效评价工程技术研究中心，3.重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 400715）

黄连始载于《神农本草经》，为毛茛科植物黄连（Coptis Chinesis Franch）、三角叶黄连（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao）或云连（Coptis teeta Wall）的干燥根茎。其性味苦、寒，归心、胃、脾、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功能。《本草纲目》明确记载黄连具有治疗“孕妇心烦，不能睡眠”的作用；临床上，黄连常作为治疗失眠复方的主药，如黄连阿胶汤、交泰丸等［1］。主要用于治疗心肾不足、阴虚火旺等症状，具有静心、安神的功效，被广泛用于神经衰弱［2］、失眠等病症。黄连的活性成分为黄连生物碱，主要为小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱和药根碱等［3］。目前，关于小檗碱的镇静安神和促进睡眠方面的研究工作较多［4－6］，但对黄连其他生物碱在促进睡眠方面的研究却鲜有报道。本研究在已获得黄连主要生物碱单体的基础上［7］，系统比较了5种黄连主要生物碱单体对小鼠睡眠及其神经递质的影响。

1 材料

1.1 仪器 ZZ-6小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；精密电子天平（德国赛多利斯仪器系统有限公司）；Direct-Q3超纯水系统（德国默克密理博仪器有限公司）；高速匀浆机（美国VWR国际有限公司）；Avanti J-301高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；LC-6AD高效液相色谱仪RF-10AXL荧光检测器（日本岛津公司）。

1.2 试剂与药品 醋酸钠、甲醇为色谱纯，分别购自阿拉丁和天津市科密欧化学试剂有限公司。其他试剂为分析纯，水为超纯水；地西泮片（天津力生制药股份有限公司，批号20120310）；戊巴比妥钠片（北京化学试剂公司，批号120812）；标准品DA、NE和5-HT（美国Sigma公司，批号分别为1001423402、1001171997、1001344074）；PCPA（东京化成工业株式会社）；小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱和药根碱由西南大学药用资源化学研究所提供。

1.3 动物 SPF级昆明种♀小鼠315只，体质量（20±2）g，购于重庆市中药研究院实验动物研究中心，生产许可证号SCXK（渝）2012－0006。自由饮食平衡1周，光照节律 ∶12 L－12 D（7∶00－19∶00），温度（20±2）℃，湿度（55±15）%。

2 方法

2.1 分组与给药 小鼠按体重随机分为7组：对照组、地西泮组、小檗碱组、黄连碱组、巴马汀组、表小檗碱组和药根碱组，每组10只。地西泮组ig 2.25 mg·kg－1·d－1，各黄连生物碱组 ig 75 mg·kg－1·d－1，对照组则灌胃等体积的生理盐水，连续给药5 d。

2.2 自主活动次数测试 末次给药后，将小鼠放入自主活动仪中，待其适应环境3 min后，分别记录其0、1、2、3 h时，小鼠5 min内的自主活动次数。

2.3 阈上剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验 小鼠分组与给药同“2.1”项。末次给药1 h后，每只ip阈上剂量的戊巴比妥钠60 mg· kg－1，给药容积0.01 ml·g－1。给药后立刻记时并观察和记录小鼠睡眠的潜伏期（从注射戊巴比妥钠后到小鼠翻正反射消失的时间段）和睡眠期（从翻正反射消失到翻正反射恢复的时间段）［8］。

2.4 阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验 小鼠分组与给药同“2.1”项。末次给药1 h后，每只ip给予阈下剂量的戊巴比妥钠30 mg· kg－1，给药容积0.01 ml· g－1，观察并记录小鼠发生睡眠只数［9］。

2.5 小鼠脑组织神经递质的检测

2.5.1 分组与给药 分组：小鼠按体重随机分为7组：对照组、模型组、小檗碱组、黄连碱组、巴马汀组、表小檗碱组和药根碱组，每组10只。造模：除对照组ip生理盐水外，其余各组连续2 d ip 300 mg·kg－1PCPA。给药：各黄连生物碱组同“2.1”项，对照组及模型组灌胃等体积的生理盐水，连续给药5 d。

2.5.2 脑组织取材及处理 末次给药1 h后，将其断头处死，迅速在冰盘上剥离出小鼠的下丘脑，并称重，吸取冰冷的 0.4 mol·L－1的 HClO4，冰浴下匀浆5 min，涡旋2 min，低温高速离心2次（4℃，14 000 r·min－1，10 min），取上清液经 0.2μm滤膜过滤，作为进样品。

2.5.3 色谱条件 色谱柱：依利特Hypersil ODS2 C18柱（4.6mm×200mm，5μm）；流动相0.1mol·L－1的醋酸钠缓冲液（含 0.1 mmol·L－1的 EDTA-2Na，pH 5.1）与色谱甲醇体积比 9∶1，进样量 20 μl／次，流速 1 ml·min－1，柱温 30℃，发射波长 330 nm，激发波长290 nm。

2.6 统计学处理 采用SPSS 17.0 for Windows软件进行单因素方差统计分析，多组间比较采用LSD-t检验，数据用¯±s表示。

3 结果

3.1 对小鼠自主活动的影响 如Tab 1所示，与对照组相比，地西泮组在给药后1、2、3 h明显减少小鼠自主活动的站立次数（P＜0.01）。小檗碱组和黄连碱组在给药后均能降低小鼠活力（P＜0.05）。其余各组在不同的时间段差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 对阈上剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响

Fig 1、2所示，与对照组相比，小檗碱组和地西泮组能缩短小鼠睡眠潜伏期，同时明显延长小鼠的睡眠时间（P＜0.01）。黄连碱组潜伏期缩短了30.0%（P＜0.01），睡眠期延长了 27.9%（P＜0.05）。其余各组的小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间差异无显著性（P＞0.05）。

Tab 1 Com parison of times of spontaneousmotor activity in juvenilem ice among groups（x¯±s，n＝10）

Tab 1 Com parison of times of spontaneousmotor activity in juvenilem ice among groups（x¯±s，n＝10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Group After administration 0 h 1 h 2 h 3 h Control 64.2±10.5 58.4±9.3 60.5±9.4 65.6±8.2 Diazepam 62.6±11.5 32.6±6.2** 35.3±7.2** 38.3±5.4**Bererine 61.8±9.3 38.7±7.8* 42.3±6.7* 44.9±7.8*Coptisine 63.0±9.7 40.1±9.7* 42.8±8.6* 46.6±9.5*Palmatine 62.5±11.4 65.8±12.5 69.4±8.4 74.7±10.2 Epiberberine 60.2±8.1 59.4±8.9 63.8±11.0 59.2±9.3 Jatrorrhizine 63.7±10.3 60.2±8.1 58.9±7.2 60.3±9.6

Fig 1 Effect of five Coptidis alkaloids period of sleep latency of pentobarbital in suprathreshold dose on juvenilem ice（n＝10）1：Control；2：Diazepam；3：Bererine；4：Coptisine；5：Palmatine；6：Epiberberine；7：Jatrorrhizine.**P＜0.01 vs control.

Fig 2 Effect of five Coptidis alkaloids period of sleeping time of pentobarbital in suprathreshold dose on juvenilem ice（n＝10）1：Control；2：Diazepam；3：Bererine；4：Coptisine；5：Palmatine；6：Epiberberine；7：Jatrorrhizine.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

3.3 对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响Tab 2结果显示，腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠的对照组小鼠无翻正反射消失，阳性药物地西泮组翻正反射行为几乎全部消失，小檗碱组和黄连碱组的翻正反射消失率明显增加。提示小檗碱和黄连碱有明显协同戊巴比妥钠促进小鼠睡眠的作用。

Tab 2 Effect of five Coptidis alkaloids on sedative and hypnotic function of pentobarbital sodium with a subthreshold dose in m ice（n＝15）

3.4 对小鼠下丘脑神经递质含量的影响 Fig 3为3种神经递质的高效液相色谱图，此条件下供试品溶液中的各神经递质和杂峰相互间分离良好［10］。

Fig 3 HPLC graph of three neurotransm ittersA.Standard；B.Sample；1：NE；2：DA；3：5-HT

从Tab 3可知，与对照组相比，模型组的NE和5-HT含量极大减少（P＜0.01）。小檗碱组和黄连碱组的NE明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，小檗碱组和黄连碱组的NE和5-HT含量明显增加（P＜0.01）；但各组间的 DA含量无差异（P＞0.05）。

Tab 3 Change of the hypothalam ic neurotransm itters content in juvenilem ice among groups（±s，n＝10，ng·g－1）

Tab 3 Change of the hypothalam ic neurotransm itters content in juvenilem ice among groups（±s，n＝10，ng·g－1）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs model

Group NE DA 5-HT Control 1180.25±64.02 252.04±13.64 465.79±26.23 Model 698.34±67.92** 238.67±17.02 231.67±22.54**Bererine 997.18±44.84*＃＃ 266.28±18.75 434.58±24.58＃＃Coptisine 1018.54±77.52*＃＃ 264.13±11.36 402.26±17.09＃＃Palmatine 752.67±89.40 241.97±14.24 201.74±15.31 Epiberberine 714.21±30.56 247.58±13.50 263.47±20.42 Jatrorrhizine 690.98±59.37 267.46±11.45 247.18±15.94

4 讨论

黄连的使用在我国拥有悠久的历史。出自张仲景《伤寒论》的方剂黄连阿胶汤在现代临床上被广泛用于治疗神经衰弱、失眠［11］等病症。现代药理研究发现，黄连中小檗碱高剂量时可抑制小鼠大脑皮层兴奋过程［12］。据徐锦堂等［13］研究表明，黄连具有中枢抑制作用。本研究结果显示，5种黄连生物碱中，小檗碱和黄连碱均能明显减弱小鼠自主活动能力，明显缩短阈上剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的潜伏期，延长其睡眠时间，并增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡率，提示小檗碱和黄连碱均具有镇静、协同戊巴比妥钠促睡眠作用，但黄连碱的药效作用低于小檗碱。此外，巴马汀、表小檗碱和药根碱对小鼠睡眠无明显作用。

目前研究显示，下丘脑 －垂体 －肾上腺素（HPA）轴与睡眠相关，可通过HPA轴与DA和5-HT相互作用［14］，来维持相关因子的正常水平，改善睡眠状态。在促睡眠的物质基础研究中发现，睡眠与NE、DA和5-HT等在内的诸多神经递质关系密切。DA是促觉醒类的神经递质，多巴胺能神经元在睡眠－觉醒中起到重要的调节作用［15］。在神经递质含量测定中，本研究中各组别之间DA含量差异无统计学意义，因而在下丘脑中DA可能未参与小鼠的睡眠作用。据文献报道［16］，下丘脑部位直接对睡眠进行调控。在注射了5-HT合成抑制剂 PCPA小鼠的下丘脑中，其5-HT含量明显减少，HPA轴呈兴奋状态。各组小鼠的昼夜节律紊乱，小鼠白昼睡眠行为几乎消失，表明PCPA小鼠失眠模型造模成功。现代药理研究表明，5-HT增多与促睡眠有关［17］。文献报道，大鼠下丘脑视前区5-HT含量增加可引起中枢性疲劳，并促进睡眠，而NE主要以兴奋中枢和觉醒功能为主，两者之间存在相互抑制作用［18－19］。本研究结果显示，小檗碱组和黄连碱组的NE和5-HT与模型组相比明显升高（P＜0.01），其HPA轴受到抑制，5-HT与对照组相比无差异（P＞0.05），但 NE的含量低于对照组（P＜0.05），即在给予受试药物后，小鼠下丘脑中5-HT含量的升高相对抑制了NE含量恢复到正常水平，符合文献报道。综上所述，黄连生物碱中小檗碱和黄连碱可能通过抑制HPA轴，增加PCPA小鼠失眠模型下丘脑中5-HT和NE的含量，来发挥一定的镇静、催眠的作用。5种黄连生物碱中，小檗碱促小鼠睡眠作用强于黄连碱，而表小檗碱、药根碱和巴马汀对小鼠睡眠无明显影响。

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