p38 MAPK信号通路在异氟醚诱导新生大鼠海马神经细胞凋亡的作用

廖朝霞，王 飞，曹德雄，柳垂亮，李玉娟

（1.中山大学孙逸仙纪念医院麻醉科，广东广州 510120；2.广东省佛山市禅城中心医院麻醉科，广东佛山 528030）

吸入麻醉药异氟醚是临床常用的吸入麻醉药。目前有多篇研究报道异氟醚可导致哺乳类动物（包括啮齿类，灵长类等）发育期大脑神经细胞毒性并损害幼年和成年时期的空间学习记忆［1－3］，而诱导发育神经细胞凋亡是异氟醚神经毒性的主要机制之一，但其诱导凋亡的信号调节通路目前尚未完全明确。

丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）为丝氨酸－苏氨酸蛋白激酶，介导信号从细胞表面向核内传递的重要信号系统，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理过程。p38 MAPK是MAPKs家族中重要的一员，主要介导炎症、应激、损伤等信号传递，能被促炎细胞因子、毒素等应激因素所激活，在调节炎症反应、神经退行性改变和神经细胞凋亡过程中发挥作用，p38通路异常过度激活可导致细胞生长停滞和凋亡［4］。

我们前期研究发现，异氟醚和七氟醚诱导的发育幼鼠神经细胞凋亡过程中，可以不同程度地影响MAPK通路的活性，异氟醚可以同时减少磷酸化ERK1／2表达，增加磷酸化 JNK和磷酸化 p38表达［5］，诱导更多的神经细胞凋亡。JNK抑制剂可以减少异氟醚诱导的幼鼠海马神经细胞凋亡，提示JNK信号通路激活参与了异氟醚诱导的发育期海马神经细胞毒性［6］。是否p38 MAPK也参与了异氟醚诱导的发育期海马神经细胞毒性目前未见相关报道。本研究拟使用p38 MAPK抑制剂观察p38 MAPK信号通路在异氟醚诱导的发育大鼠神经细胞凋亡中的作用。

1 方法

1.1 仪器与试剂 麻醉气体检测仪（美国欧米达公司），Olympus IX70倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。异氟醚（美国雅培制药有限公司），SB203580（美国Selleck公司）。一抗均为兔抗大鼠（美国Cell Signal生物技术公司），羊抗兔二抗（武汉博士德公司），TUNEL荧光染色试剂盒（美国Promega公司），Hoechst33258染色液（碧云天生物技术研究所）。

1.2 动物处理及分组 出生后7 d（P7）的SD大鼠，随机分为4组：空气 ＋DMSO组（Air＋DMSO组）、空气 ＋SB203580组（Air＋SB20组）、异氟醚 ＋DMSO组（Iso＋DMSO组）、异氟醚 ＋SB203580组（Iso＋SB20组）。其中SB203580为p38 MAPK抑制剂，溶解于DMSO，经侧脑室注射，SB203580的注射剂量为20 nmol。前2组吸入空气，后2组吸入体积分数为0.011异氟醚4 h。DMSO组与抑制剂组在处理前30min侧脑室注射体积分数为0.1DMSO或p38 MAPK抑制剂5μl。幼鼠麻醉结束后6 h，一部分断头取脑，取新鲜的海马组织，Western blot方法检测海马激活型 caspase-3，磷酸化 p38（phosphop38，p-p38）及其下游分子磷酸化 NF-κB（phospho-NF-κB，p-NF-κB），Bax和Bcl-2等蛋白的表达；一部分幼鼠经心脏灌注后取脑组织，使用原位末端转移酶标记（terminal deoxyribonucleotide transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法检测海马神经细胞凋亡。

1.3 麻醉处理 按照我们以前报道的方法［5－6］，将新生大鼠放置于密闭麻醉箱中，该麻醉箱放置于预设温度为37℃的水浴箱中。麻醉箱与麻醉机相连，Iso组使用体积分数为0.011的异氟醚处理4 h，空气组则吸入空气，麻醉气体通过麻醉机的挥发罐由压缩空气输送通过该麻醉箱，气体流量为2 L·min－1。幼鼠呼气末麻醉气体的浓度、氧气和二氧化碳浓度由连接于麻醉箱的麻醉气体监测仪监测。

1.4 组织处理 各组分别在麻醉处理结束后6 h，取6只幼鼠，断头取脑，冰上分离脑海马组织，液氮速冻后转移至－80℃保存，组织用来做Western blot分析。另外在麻醉结束6 h后每组均取6只幼鼠，经心脏灌注40 g·L－1多聚甲醛固定液15 min后取脑。脑组织在同样的灌注液中4℃后固定48 h后梯度脱水，石蜡包埋，参照幼鼠脑解剖图谱，分别在前囟－3.14～－4.16 mm区经冠状平面切取5μm连续石蜡切片，每隔200μm取3个脑片，每个脑组织取18张脑片，进行TUNEL染色。

1.5 W estern blot 按照我们以前报道的方法［5－6］。简述如下，新鲜冰冻的脑海马组织经超声裂解后提取蛋白，根据其蛋白浓度（BCA法测定），配平使各样本蛋白等量。1∶1 000兔抗大鼠cleaved caspase-3多克隆抗体，1∶1 000兔抗大鼠pp38抗体，1∶1 000兔抗大鼠p38抗体，1∶1 000兔抗大鼠p-NF-κB抗体，1∶1 000兔抗大鼠Bax抗体，1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2抗体以及1∶2 000β-actin，4℃孵育过夜，1∶5 000二抗室温孵育1 h，使用ECL进行胶片显影。

1.6 TUNEL 参照我们以前报道的方法进行［6］。简述如下，石蜡组织切片脱蜡水化后，蛋白酶 K工作液（20 mg· L－1）室温反应15 min，平衡缓冲液分别处理10 min，每个样本滴加50μl的酶反应液（TdT 5μl，荧光素连接的dUTP混合缓冲液45μl）于37℃、湿盒中避光孵育60 min。去离子水终止反应，Hoechst33258避光反应5 min，抗荧光淬灭封片剂封片。Olympus IX70倒置荧光显微镜获得海马CA1区200×图像用Image-Pro Plus软件进行图像分析，并采用盲法计算单位面积的阳性细胞数。

1.7 统计学分析 实验数据经SPSS 13.0软件进行统计学分析，以¯x±s表示，以Graphpad Prism 6.0统计软件分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，组间采用Turkey法检验进一步对各组进行比较。

2 结果

2.1 SB203580减少了异氟醚诱导的新生鼠海马神经细胞凋亡 在幼鼠海马CA1区，Iso＋DMSO组单位面积（mm2）的 TUNEL阳性细胞数（133.71±30.19），比 Air＋DMSO组（22.74±11.92）增加了约4.8倍（P＜0.01），而 Iso＋SB20组的单位面积（mm2）TUNEL阳性细胞（51.05±10.25）比 Iso＋DMSO组降低了约 3／5（P＜0.01）（Fig 1，Tab 1）。Western blot检测海马早期凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达，结果发现异氟醚增加了海马cleaved caspase-3的表达（P＝0.003），而 SB203580逆转了异氟醚诱导的cleaved caspase-3的表达增多（P＝0.007）。上述结果提示p38抑制剂可以减轻异氟醚诱导的神经细胞凋亡（Fig 2，Tab 2）。Air＋SB20组TUNEL阳性细胞数目及cleaved caspase-3表达与Air＋DMSO组比较差异无统计学意义，说明SB203580本身不会引起神经细胞凋亡。

Tab 1 Effect of SB203580 on isoflurane-induced increase of TUNEL positive cells in hippocampus CA1 area（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of SB203580 on isoflurane-induced increase of TUNEL positive cells in hippocampus CA1 area（±s，n＝6）

The count of TUNEL positive cellswas catulated by diving the number of TUNEL positive cells by the area of hippocampus CA1.**P＜0.01 vs Air＋DMSO；＃＃P＜0.01 vs Iso＋DMSO

Group TUNEL positive cells／mm－2 Air＋DMSO 22.710±5.964 Air＋SB20 20.367±4.273 Iso＋DMSO 133.714±7.503**Iso＋SB20 39.964±5.139＃＃

2.2 SB203580对异氟醚麻醉诱导的海马p-p38及其下游p-NF-κB表达的影响 与Air＋DMSO组比较，Iso＋DMSO组幼鼠海马p38（P＜0.01）及其下游 NF-κB（P＝0.004）的磷酸化表达增加，提示异氟醚麻醉激活了p38 MAPK通路。与Iso＋DMSO组比较，Iso＋SB20组 p-p38（P＜0.01）及 p-NF-κB（P＝0.028）的表达降低，提示p38抑制剂SB203580抑制了异氟醚诱导的p38及其下游NF-κB的激活。Air＋SB20组p-p38及p-NF-κB表达与Air＋DMSO组差异无统计学意义，说明SB203580对正常幼鼠的p38及 NF-κB活性没有明显影响（Fig 2，Tab 2）。

Fig 1 TUNEL positive cell in hippocam pus CA1 area（×200）Representative photomicrographs of Hoechest-and TUNEL-positive cells.Green staining indicated TUNEL positive cells and blue staining indicated nuclei.Scan bar＝50μm.

Fig 2 Expression of cleaved caspase-3，phospho-p38，p38，phospho-NF-κB，Bcl-2 and Bax proteins in hippocam pus by W estern blot

2.3 SB203580对异氟醚麻醉诱导的新生大鼠海马Bax和Bcl-2蛋白表达的变化 与Air＋DMSO组比，Iso＋DMSO组海马 Bax表达增加（P＜0.01）和Bcl-2表达降低（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值下降（P＜0.01），提示异氟醚麻醉激活了Bcl-2家族凋亡相关蛋白通路；与Iso＋DMSO组相比，Iso＋SB20组幼鼠海马 Bax表达下调（P＜0.01），Bcl-2表达增加（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值上升（P＝0.006），提示 p38抑制剂SB203580逆转了异氟醚诱导的Bcl-2家族凋亡相关蛋白的变化。Air＋SB20组Bax和Bcl-2蛋白表达与Air＋DMSO组比较差异无统计学意义，提示SB203580本身不会引起Bcl-2家族凋亡相关蛋白的变化（Fig 2，Tab 2）。

3 讨论

本研究结果发现异氟醚可以通过诱导p38及其下游分子NF-κB磷酸化表达增加而激活p38 MAPK通路，并且通过增加Bax表达，降低Bcl-2的表达，从而降低Bcl-2／Bax比值，诱导海马神经细胞凋亡。而p38抑制剂SB203580能通过抑制异氟醚诱导的p38及NF-κB磷酸化激活，逆转异氟醚诱导的Bax、Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2／Bax比值的变化，减轻异氟醚麻醉引起的神经细胞凋亡。结果提示，p38 MAPK信号通路激活是异氟醚引起的幼鼠海马神经细胞凋亡的机制之一。

凋亡是异氟醚诱导发育神经细胞毒性的主要机制之一。TUNEL是检测细胞凋亡的金指标，而caspase-3是检测早期细胞凋亡的常用指标。有研究报道［7］，异氟醚麻醉诱导神经细胞凋亡的高峰时间发生在麻醉结束后6 h左右。本研究发现，在麻醉后6h，异氟醚麻醉可以引起突触发育期SD大鼠海马cleaved caspase-3表达增加，TUNEL染色阳性数目增加，与其他学者报道以及我们前期研究结果一致［5－7］。

Tab 2 Effects of SB203580 on isoflurane-induced activation of p38／NF-κB pathway and apoptosis pathway（±s，n＝6）

Tab 2 Effects of SB203580 on isoflurane-induced activation of p38／NF-κB pathway and apoptosis pathway（±s，n＝6）

The objective of protein bandswasexpressed by the density ratio of the corresponding band toβ-actin or p38 after densitometric analysis.Each value was presented after normalization.**P＜0.01 vs Air＋DMSO；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Iso＋DMSO

Group cleaved caspase-3／β-actin p-p38／p38 p-NF-κB／β-actin Bax／β-actin Bcl-2／β-actin Bcl-2／Bax Air＋DMSO 1.000±0.163 1.073±0.147 0.993±0.130 0.964±0.137 0.989±0.111 1.030±0.103 Air＋SB20 0.946±0.218 0.965±0.223 0.931±0.136 0.922±0.142 0.892±0.130 0.977±0.179 Iso＋DMSO 2.095±0.383** 1.887±0.426** 1.662±0.233** 1.960±0.354** 0.328±0.260** 0.278±0.156**Iso＋SB20 1.210±0.270＃＃ 1.173±0.173＃＃ 1.172±0.163＃ 1.100±0.273＃＃ 0.987±0.254＃＃ 0.587±0.121＃＃

异氟醚诱导发育神经细胞凋亡的机制中，线粒体凋亡通路起着重要的作用。Bcl-2家族蛋白的表达平衡对维持正常的线粒体膜电位至关重要。我们前期的研究结果也发现可通过抑制Akt／Bad通路，减少Bad磷酸化，降低Bcl-xl／Bad比值诱导幼鼠皮质和海马神经细胞凋亡［8－10］。小鼠在体和离体模型均证实了暴露于体积分数为0.02的异氟醚6h可以上调神经元Bax水平，降低Bcl-2表达，同时增加ROS的蓄积，促进细胞色素C从线粒体释放到胞质，导致caspase-9和caspase-3的激活，最终引起细胞凋亡［11］。这与本研究发现的积分数为0.011的异氟醚增加P7大鼠海马Bax水平，降低Bcl-2表达以及降低Bcl-2／Bax比值的结果一致。此外，异氟醚也可通过开放线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）介导对小鼠海马神经元的毒性，提高ROS的水平，降低线粒体膜电位和 ATP的生成，激活 caspase-3，促进细胞凋亡［12］。

异氟醚不仅能诱导发育期神经细胞凋亡，且短时间的异氟醚预处理对缺血大鼠模型和缺氧皮质神经元均有神经保护作用。Zheng等［13］发现体积分数为0.02的异氟醚预处理对大鼠脑缺血的神经保护作用与p38 MAPK通路激活密切相关。Bickler等［14］则发现异氟醚减少缺氧皮质神经元凋亡的作用与异氟醚诱导的细胞内Ca2＋浓度轻度增加，以及Ca2＋依赖的 Pyk2／ERK，JNK／C-Jun和 PI3-kinase／Akt通路激活有关；然而单独的异氟醚或缺氧均可诱导皮质神经元凋亡和p38磷酸化增加，异氟醚和缺氧共同处理的神经元中p38磷酸化则减少，这是否与异氟醚预处理的神经保护作用有关还不清楚。

p38 MAPK信号通路，在神经细胞凋亡过程中也可发挥重要作用［15－16］。研究发现 p38 MAPK的激活与阿尔采末病中β-淀粉样沉积和tau蛋白高度磷酸化引起的神经元凋亡密切相关［17－18］；p75神经营养受体表达增加引起的氧自由基在线粒体的积聚和细胞凋亡也依赖于 p38 MAPK磷酸化激活［19］。我们前期的研究也发现异氟醚增加了幼鼠皮质神经细胞凋亡和p38 MAPK磷酸化表达［5］。本研究进一步发现积分数为0.011的异氟醚诱导幼鼠海马神经细胞凋亡的同时，也增加了海马p38 MAPK与其下游NF-κB的磷酸化表达，说明异氟醚麻醉也激活了p38 MAPK信号通路。

p38 MAPK激活后，一方面可以直接激活Bax转移并插入线粒体外膜。在线粒体外膜，Bax发生寡聚体化，形成MPTP，影响线粒体膜通透性，细胞色素 C释放至胞质，caspase级联反应被激活，cleaved caspase-3表达增加而诱导细胞凋亡［16，20］。另一方面，磷酸化p38还可以磷酸化核转录因子NF-κB，激活的NF-κB可与许多靶基因的特异性同源DNA序列结合，调控细胞核凋亡相关基因的表达。本研究发现，p38特异性抑制剂SB203580不仅逆转了异氟醚诱导的p38 MAPK与其下游NF-κB蛋白磷酸化激活，也逆转了异氟醚诱导的Bax、Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2／Bax比值的变化，减轻了异氟醚诱导的幼鼠海马caspase-3激活和细胞凋亡，提示SB203580可以从线粒体通路以及细胞核通路两方面减轻异氟醚麻醉引起的神经细胞凋亡。Ghatan等［21］使用人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和原代皮质细胞进行研究，发现一氧化氮（NO）诱导的细胞凋亡与激活p38 MAPK，促进Bax从胞质向线粒体转移，增加线粒体膜通透性有关，与我们的结果一致。虽然本研究结果提示p38 MAPK激活参与了异氟醚诱导的神经细胞凋亡，但是对于p38 MAPK激活后线粒体凋亡通路和细胞核凋亡通路哪一个优先启动，那一条通路占有主导地位，本研究尚不能得出结论。

已证明 p38 MAPK／NF-κB通路激活与炎症反应密切相关［22］，而近期的研究发现神经炎症可以促进吸入麻醉药诱导的神经细胞凋亡和认知功能障碍［23－25］。异氟醚麻醉可以增加老年小鼠海马促炎性细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平，而且NF-κB激活参与了异氟醚引起的海马IL-1β和IL-6水平增加［25］。使用IL-1β基因敲除的小鼠可以改善异氟醚诱导的认知功能障碍，提示IL-1β激活参与了异氟醚诱导的认知功能障碍［23－24］。而 Shen等［26］发现使用抗炎药能减轻七氟醚诱导的幼鼠神经毒性和认知功能损害，提示神经炎性通路的激活与吸入麻醉药的神经毒性密切相关。我们的结果显示p38抑制剂 SB203580抑制p38 MAPK／NF-κB通路激活，推测异氟醚诱导的神经细胞凋亡有可能与激活p38 MAPK／NF-κB通路引起的神经炎症有关，确切的结论需要进一步检测海马炎性因子的表达变化来证明。

本研究的不足之处在于没有应用NF-κB抑制剂深入探讨NF-κB通路下游的蛋白变化，没有检测异氟醚和p38 MAPK／NF-κB通路抑制剂对幼鼠海马促炎性细胞因子IL-1β和IL-6表达水平的影响，以及对幼鼠成年期的认知功能的影响。这些需在以后的研究中进一步完善。

总之，本研究通过建立P7新生大鼠吸入体积分数为0.011的异氟醚4 h模型，并联合使用p38抑制剂SB203580处理，发现异氟醚可通过激活p38 MAPK通路来诱导新生大鼠海马神经细胞的凋亡。

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