鹰嘴豆芽素A对雌激素缺乏诱发大鼠骨质疏松症的作用

周延萌，宁慧娴，张小敏，高允生，武继彪

（1.山东中医药大学基础医学院，山东济南 250355；2.泰山医学院药学院，山东 泰安 271016）

骨质疏松（osteoporosis，OP）是以骨量减少，骨组织微细结构破坏，骨脆性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，是最常见的老年性骨代谢疾病，女性因绝经后雌激素明显缺乏而易发生。鹰嘴豆芽素A（biochanin A）来源于豆科植物鹰嘴豆种子的胚芽部分，红车轴草全草等，已证实具有雌激素样作用。本研究通过去卵巢手术，建立大鼠绝经后骨质疏松动物模型，研究鹰嘴豆芽素A对去卵巢骨质疏松大鼠的作用，并观察其对大鼠乳腺组织的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用60只6月龄♀ Wistar大鼠，体质量（300±30）g，山东鲁抗医药股份有限公司，动物合格证号：SCXK（鲁）2005－0017。

1.2 药物及试剂 鹰嘴豆芽素A（陕西慈缘生物技术有限公司，含量为99.67%）；β-雌二醇（Sigma公司）；雌二醇放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3 实验仪器 DPX-L型双能X线骨密度仪（美国Lunar公司）；SN695型放射免疫计数器（上海日环仪器厂）；RM2145型石蜡切片机（德国LEICA公司）。

1.4 药物配制 取鹰嘴豆芽素A，用无水乙醇、吐温80、蒸馏水以1∶1∶8充分搅拌溶解［1］，按 10 ml·kg－1体积配成不同剂量组（7，20，60 mg·kg－1）；β-雌二醇也用无水乙醇、吐温80、蒸馏水以1∶1∶8配制，给药剂量为 0.35 mg·kg－1。

1.5 模型制备及给药 大鼠10%水合氯醛（0.3 ml／100 g）麻醉后，无菌条件下切除双侧卵巢，假手术组只切除卵巢附近一块脂肪组织。术后d 8，对去卵巢大鼠进行连续5 d的阴道涂片检查，所有大鼠未处于动情周期，用于试验。术后第4周开始灌胃给药，假手术组及去卵巢模型组大鼠给予等容量溶剂，连续12周。

1.6 指标及方法

1.6.1 股骨骨密度测定 取左后肢股骨，剥离干净后以纱布包裹标号，放于生理盐水中，置于－20℃冰箱中待测骨密度。采用DPX-L型双能X线骨密度检测仪测试大鼠股骨骨密度。

1.6.2 雌激素水平测定 末次给药6 h后，大鼠股动脉取血，进行雌激素水平测定。血清雌二醇含量用放射免疫法测定。

1.6.3 胫骨、乳腺组织形态学观察 取大鼠同侧胫骨和乳腺，迅速浸入10%的福尔马林固定，胫骨用硝酸法脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察胫骨和乳腺组织形态变化。

1.7 统计学处理 各项参数均表示为¯x±s，采用SPSS 12.0统计软件进行分析，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 鹰嘴豆芽素A对OVX大鼠体重的影响 在造模的4个月时间里，模型组大鼠体重增长较快，在给予鹰嘴豆芽素A3个月过程中，大鼠体重的增长有所控制，与假手术组相近。雌激素组与模型组比较体重明显下降（P＜0.05），见Tab 1。

2.2 鹰嘴豆芽素A对OVX大鼠股骨骨密度的影响 结果表明，模型组大鼠股骨骨密度与假手术组比较明显降低（P＜0.05）。鹰嘴豆芽素A和雌二醇能明显增加骨质疏松大鼠股骨的骨密度，其中高、中剂量组效果明显（P＜0.01），见 Tab 2。

2.3 鹰嘴豆芽素A对OVX大鼠体内雌激素水平的影响结果表明，与假手术组比较模型组大鼠血清E2水平降低（P＜0.05）。应用鹰嘴豆芽素A治疗后，大鼠体内E2水平不同程度升高，特别是高、中剂量组大鼠体内E2升高明显（P＜0.05），见 Tab 3。

2.4 大鼠胫骨组织形态学观察 显微镜下，假手术组大鼠胫骨骨松质结构清楚，骨小梁粗细均匀，相互连接成网状，骨髓充满骨髓腔。去卵巢大鼠骨小梁稀疏、细小，骨髓腔内含有大量脂肪细胞。鹰嘴豆芽素A各剂量组和雌激素组与模型组比较，骨组织形态均有不同程度的改善：骨小梁增多，较为粗大，且有些骨小梁相互连接，骨髓腔内脂肪细胞减少。

2.5 大鼠乳腺组织形态学观察 假手术组腺泡较少，腺管稍扩张，去卵巢组未见腺泡，脂肪组织及结缔组织与其他组比较稍少，乳腺呈萎缩状态，鹰嘴豆芽素A低剂量组及中剂量组与模型组差异无显著性，高剂量组腺泡明显增多甚至多于雌激素组，腺管囊性扩张。

Tab 1 Effects of biochanin A on rat weight（±s，n＝8）

Tab 1 Effects of biochanin A on rat weight（±s，n＝8）

*P＜0.05 vs model

Group Dose／mg·kg－1 Weight／g 30 days 60 days 90 days 120 days Sham － 354.20±32.91 390.36±37.61 403.92±40.67 429.92±48.05 Model － 352.33±13.60 390.60±13.13 432.18±11.96 461.27±15.87 E2 0.35 362.17±23.35 373.57±21.62 387.80±23.97 386.39±35.43*Bio A 7 361.50±24.82 375.61±13.97 408.40±26.38 432.00±23.59 Bio A 20 351.76±39.18 367.17±31.77 410.00±29.40 425.57±30.09 Bio A 60 364.67±29.04 375.57±33.40 402.91±37.92 413.83±45.21

Tab 2 Effects of biochanin A on BMD of rat femur（±s，n＝8）

Tab 2 Effects of biochanin A on BMD of rat femur（±s，n＝8）

＃P＜0.05 vs sham；**P＜0.01 vs model

Group Dose／mg·kg－1 Femur BMD／g·cm－2 Sham － 0.173±0.004 Model － 0.164±0.002＃E2 0.35 0.170±0.004 Bio A 7 0.171±0.004 Bio A 20 0.177±0.003**Bio A 60 0.183±0.002**

Tab 3 Effects of biochanin A on rat E2¯±s，n＝8）

Tab 3 Effects of biochanin A on rat E2¯±s，n＝8）

＃P＜0.05 vs sham；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model

Group Dose／mg·kg－1 E2／ng·L－1 Sham － 2.076±0.712 Model － 1.185±0.132＃E2 0.35 2.323±0.875**Bio A 7 1.427±0.493 Bio A 20 1.977±0.332*Bio A 60 2.099±0.644*

3 讨论

原发性骨质疏松主要是雌激素缺乏。当♀大鼠的卵巢被切除后，由于雌激素缺乏，导致骨代谢不平衡，成骨细胞活动减弱，造成骨形成不足，活化破骨细胞，骨吸收亢进，松质骨出现明显的骨丢失，骨强度下降，这些松质骨的骨丢失是伴随骨转换增强而进行的，这种特性和人正常绝经后高转换型骨质疏松的骨丢失状态有许多相似之处［2］。大鼠卵巢切除模型已被公认为金标准模型。去卵巢大鼠由于体内雌激素水平下降，引起脂代谢紊乱，导致肥胖。大鼠体重明显增加，可部分抑制去卵巢大鼠的骨丢失，肥胖妇女绝经后骨质疏松和骨折发病率较低可能与此有关［3］。

虽然植物雌激素被认为是一种天然的雌激素受体调节剂，与雌激素有很大不同。多数资料显示，植物雌激素对乳腺的作用还没有定论。本实验中，大鼠去势后乳腺组织明显萎缩，未见明显腺泡结构，给予鹰嘴豆芽素A低、中剂量治疗后，乳腺组织仍呈萎缩状态，未见明显腺泡结构，说明一定剂量范围内的鹰嘴豆芽素A对乳腺组织没有刺激增生和癌变的作用。但是高剂量的鹰嘴豆芽素A对乳腺组织的雌激素作用增强，腺泡明显增多，腺管囊性扩张。这与一些学者的高剂量异黄酮可诱导乳腺增生和癌变发生的论点吻合［4－5］，但其量效关系及机制还需进一步研究。

参考文献：

［1］ 周延萌，宋立群，马晓茜，等.红车轴草异黄酮对维甲酸致小鼠骨质疏松的预防作用［J］.中国药理学通报，2010，26（12）：1658－61.

［1］ Zhou Y M，Song LQ，Ma X Q，et al.Preventive effectof trifolium pratense isoflavones on retinoic acid induced osteoporosis in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（12）：1658－61.

［2］ 刘忠厚主编.骨质疏松学［M］.北京：人民卫生出版社，1998：511.

［2］ Liu Z H.Osteoporosis［M］.Beijing，People’smedical publishing house，1998：511.

［3］ Wronski T J，Schenck P A，Cintron X X，et al.Effect of body weight on osteopenia in ovariectomized rats［J］.Calcif Tissue Int，1987，40（3）：155－9.

［4］ Messina M，McCaskill-StevensW，Lampe JW.Addressing the soy and breast cancer relationship：review，commentary，and workshop proceedings［J］.JNatl Cancer Inst，2006，98（18）：1275－84.

［5］ Messina M.Conclusion that isoflavones exert estrogenic effects on breast tissue and may raise breast cancer risk unfounded［J］.Mol Nutr Food Res，2008，52（2）：299－300.