苯磺酸氨氯地平印迹聚合物的合成、性能及应用

许文静，张文生，张社利

（焦作师范高等专科学校 理工学院，河南 焦作 454000）

苯磺酸氨氯地平（化学名为3-乙基-5-甲基-2-（2-氨乙氧甲基）-4-（2-氯苯基）-1，4-二氢-6-甲基-3，5-吡啶二羧酸酯苯磺酸盐）为第三代双氢吡啶类钙拮抗剂，因其具有服药量低、药效维持时间长、不良反应少和保护靶器官等优点，是理想的长效降压药物，也是目前临床上治疗冠心病和高血压的重要药物［1-2］。

常用的分离检测苯磺酸氨氯地平的方法包括：高效液相色谱法［3］、紫外分光光度法［4］、反相高效液相色谱法［5］和高效毛细管电泳法［6］等，其中高效液相色谱法是分离检测苯磺酸氨氯地平的标准方法。对于生物试样（如血浆等），常用萃取法提取其中的目标物进行测定，但该方法耗费溶剂较多、对环境有污染且测试时间长［7］。

分子印迹聚合物是一种人工合成的以待分离分子为模板、具有分子识别功能的聚合物［8-10］，具有结构预定性、分子识别性、稳定性好及使用寿命长等优点，在生物活性物质、农药残留和环境污染物等的选择性富集、分离和检测方面有广泛的应用前景［11-13］。

本工作以苯磺酸氨氯地平为模板分子、丙烯酸（AA）为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂，利用本体聚合法合成了苯磺酸氨氯地平印迹聚合物（MIPs）。利用FTIR、SEM和静态吸附等方法分析了MIPs的结构及吸附性能，并将其作为分散剂应用于血浆中苯磺酸氨氯地平的富集分离。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

苯磺酸氨氯地平：纯度大于98%，常州瑞明药业有限公司；AA：分析纯，上海化学试剂公司；EGDMA：分析纯，广州双键贸易有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，广州化学试剂公司；氯仿、丙酮、甲醇、乙酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

Quonxe 2000 型扫描电子显微镜：FEI公司；LC-20AT型液相色谱仪：岛津公司；Lambda 35型紫外可见分光光度计、Spectrum 100型傅里叶变换红外光谱仪：PE公司；RFJ型小型安培瓶熔封机，吉首市中诚制药机械厂。

1.2 本体聚合合成MIPs

取苯磺酸氨氯地平0.567 1 g（1 mmol）溶于10 mL氯仿溶剂中，加入AA 0.274 5 g（4 mmol），振荡60 min；再分别加入交联剂EGDMA 3.76 mL（20 mmol）和AIBN 0.035 0 g，超声振荡20 min后通入氮气，熔封；然后置于60 ℃水浴中振荡恒温反应24 h；所得块状聚合物经粉碎后筛分，置于索氏抽提器中用甲醇与乙酸的混合溶液（体积比9∶1）抽提洗涤，直至抽提液用紫外可见分光光度计检测无分子吸收；最后用甲醇将聚合物洗涤至中性，用丙酮反复沉降，除去过细粒子，80 ℃下真空干燥24 h即得到MIPs。

非印迹聚合物（NIPs）的制备按上述方法进行，但不加苯磺酸氨氯地平。

1.3 分析方法

用傅里叶变换红外光谱仪分析MIPs和NIPs的结构，KBr压片；用扫描电子显微镜对真空干燥后的MIPs和NIPs的表面形貌进行观察。HPLC分析以Inertsil DOS-SP（4.6 mm×150 mm×5 μm）为分离柱，流动相为甲醇-乙腈-水的混合物（体积比为70∶22∶8），流量1.0 mL/min，检测波长237 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，采用标准曲线法定量。

1.4 MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附性能研究

1.4.1 吸附动力学实验

称取0.5 g MIPs或NIPs，加入质量浓度为200 mg/L的苯磺酸氨氯地平水溶液，在25 ℃恒温摇床中密闭振荡24 h，从振荡开始计时，分别在1，5，15，30 min 及1，3，5，7，9 h时抽取吸附液，离心分离，取上清液，用紫外分光光度计在237 nm处测定吸光度，考察MIPs或NIPs对苯磺酸氨氯地平分子的吸附动力学。

1.4.2 静态吸附实验

精确称取50 mg MIPs和NIPs各10份，置于150 mL磨口锥形瓶中，分别加入50 mL不同质量浓度的苯磺酸氨氯地平水溶液，在25 ℃恒温摇床中密闭振荡24 h后，离心分离，取上清液于237 nm 处测定其吸光度。吸附量（Q）计算公式如下：

式中，ρ0为苯磺酸氨氯地平初始质量浓度，mg/L；ρe为苯磺酸氨氯地平平衡质量浓度，mg/L；V为溶液体积，L；m为MIPs或NIPs的质量，g；M为苯磺酸氨氯地平的相对分子质量，567.05；Q1为摩尔吸附量，μmol/g；Q2为质量吸附量，mg/g。

1.5 MIPs用作固相分散剂

按文献［7］报道的方法制备血浆，然后准确移取0.5 mL血浆于50 mL烧杯中，加入一定量的苯磺酸氨氯地平标准溶液，混合均匀，再加入0.5 g MIPs，充分搅拌上述混合物，使待测血浆和苯磺酸氨氯地平均匀分散在MIPs中并自然风干形成固相基质。在5 mL的注射器中，下端垫一层滤纸，将上述固相基质装入，并轻轻敲实，上面加盖一层滤纸，压紧。用4 mL正己烷分2次洗涤烧杯和玻璃棒并将洗涤液淋洗注射器，弃去淋出液。再用4 mL甲醇分2次洗涤烧杯和玻璃棒并用洗涤液洗脱注射器，然后用2 mL甲醇洗脱注射器。收集3次洗脱液，浓缩至干后，溶于1.0 mL甲醇-乙腈-水的混合物（体积比为70∶22∶8）中，进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 FTIR的表征结果

MIPs和NIPs的FTIR谱图见图1。

图1 MIPs和NIPs的FTIR谱图Fig.1 FTIR spectra of MIPs and NIPs.

从图1可看出，2 991 cm-1处的吸收峰归属于C—H键的伸缩振动；1 479，1 392 cm-1处的吸收峰归属于C—H键的面内弯曲振动；1 265，1 166 cm-1处的吸收峰归属于C—O键的伸缩振动。NIPs的FTIR谱图中，归属于C—H键的伸缩振动吸收峰出现在3 565 cm-1处；归属于键的伸缩振动吸收峰出现在1 732 cm-1处。而在MIPs的FTIR谱图中，上述吸收峰分别移至3 454 cm-1和1 700 cm-1处，峰形与NIPs相比略有变化。表征结果显示，MIPs和NIPs的吸收峰具有相似的峰型和基本相同的峰位置，说明苯磺酸氨氯地平分子与AA和EGDMA分子之间的作用力为分子间作用力和氢键。

2.2 MIPs的形态分析

MIPs和NIPs的SEM照片见图2。从图2可看出，两者均具有不规则形貌的特征，这是由于制作过程中的粉碎研磨导致的。从图2a可看出，MIPs表面突起多而明显。对比图2c和d可看出，MIPs的表面粗糙，孔穴多而大；而NIPs的表面较致密，孔穴少而小。表征结果显示，在MIPs中形成了与苯磺酸氨氯地平分子相匹配的立体孔穴。这种带有苯磺酸氨氯地平分子印迹的立体孔穴有利于提高吸附性能，从而提高了MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附性和选择性。

图2 MIPs和NIPs的SEM照片Fig.2 SEM images of MIPs and NIPs.

2.3 MIPs的吸附动力学

MIPs和NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附动力学曲线见图3。由图3可知，MIPs和NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量均在起始阶段迅速增加，MIPs在前15 min内的吸附量即达到292 μmol/g，为平衡吸附量的97%，接近吸附平衡状态；NIPs在15 min内的吸附量达到215 μmol/g，为平衡吸附量的90%，也接近吸附平衡状态。MIPs比NIPs的吸附量提高了36%，说明MIPs比NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量大、吸附平衡时间稍短、吸附性能好。

图3 MIPs和NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附动力学曲线Fig.3 Adsorption kinetics curves of amlodipine besylate on MIPs and NIPs.

2.4 MIPs的吸附等温线及Scatchard分析

MIPs和NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附等温线见图4。从图4可看出，随苯磺酸氨氯地平初始质量浓度从40 mg/L增至220 mg/L，MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量从32.2 mg/g增至124.2 mg/g，而NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量从22.9 mg/g增至96.6 mg/g。实验结果表明，MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量明显高于NIPs。这是因为，在印迹过程中苯磺酸氨氯地平分子在MIPs中留下了与之空间结构相匹配的具有多重作用点的立体空穴，这种空穴对苯磺酸氨氯地平具有高度亲和力和特异识别性，而NIPs中功能团的分布是任意的，没有形成与苯磺酸氨氯地平分子在空间结构上互补的分子识别位点，对苯磺酸氨氯地平没有特异选择性。

图4 MIPs与NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附等温线Fig.4 Adsorption isotherms of amlodipine besylate on MIPs and NIPs.

为考察M I P s表面位点的分布特征，用Scatchard等温吸附模型分析了MIPs的吸附等温线（见式（3））：

式中，KD为亲和位点的平衡离解常数；Qmax为最大表观吸附量，mg/g。

苯磺酸氨氯地平在MIPs上的 Scatchard 吸附等温线见图5。从图5可看出，Q/ρe～Q呈2条斜率不同的直线，说明MIPs中主要存在2种不同类型的亲和位点。由斜率和截距可求得这2种亲和位点的KD和Qmax：高亲和位点的KD1=129.70 mg/L，Qmax1=309.49 mg/g；低亲和位点的KD2=8.56 mg/L，Qmax2=71.39 mg/g。实验结果表明，MIPs表面2种亲和位点对苯磺酸氨氯地平的最大表观吸附量分别为309.49 mg/g和71.39 mg/g。

图5 苯磺酸氨氯地平在MIPs上的 Scatchard 吸附等温线Fig.5 Scatchard adsorption isotherms of amlodipine besylate on MIPs.

2.5 MIPs富集分离血浆中苯磺酸氨氯地平

利用MIPs分散剂将含苯磺酸氨氯地平的血浆制成固相基质，经前处理后可在HPLC上检测血浆中的苯磺酸氨氯地平的含量。分散剂处理后血浆的HPLC谱图见图6。从图6可看出，保留时间为3.9 min的吸收峰归属于苯磺酸氨氯地平。以MIPs为分散剂时苯磺酸氨氯地平的加标回收率为95.4%，而以NIPs为分散剂时的加标回收率较低，血浆中的杂质不会干扰目标化合物的测定。对图6中B谱线的峰面积积分，得线性回归方程y=23 022.1x-5.731，线性范围0.5～20.0 μg/L，线性相关系数r=0.999 9，相对标准偏差RSD=1.4%，最低检测限0.5 μg/L，定量限为1.7 μg/L，符合生物试样的分析要求。应用结果表明，MIPs可对血浆中的苯磺酸氨氯地平进行有效地富集分离，且溶剂用量少，加标回收率高，操作简单易行。

图6 分散剂处理后血浆的HPLC谱图Fig.6 HPLC analysis of blood plasma after treatment with dispersants.

3 结论

1）以苯磺酸氨氯地平为模板分子、AA为单体、EGDMA为交联剂，采用本体聚合法合成了MIPs。MIPs具有与苯磺酸氨氯地平分子相匹配的孔穴，且孔穴中含有与苯磺酸氨氯地平空间结构相匹配的识别位点，从而增加了MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附性和选择性。

2）MIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量比NIPs对苯磺酸氨氯地平的吸附量提高了36%。MIPs表面存在2种不同性质的亲和位点，对苯磺酸氨氯地平的最大表观吸附量分别为309.49 mg/g和71.39 mg/g。

3）MIPs可对血浆中的苯磺酸氨氯地平进行有效地富集分离，加标回收率95.4%，血浆中的杂质不会干扰目标化合物的测定，最低检测限0.5 μg/L，定量限为1.7 μg/L，符合生物试样的分析要求，且溶剂用量少，操作简单易行。

［1］Rosenthal T，Gavras I. Fixed-Drug Combinations as First-Line Treatment for Hypertension［J］. Prog Cardiovasc Dis，2006，48（6）：416 - 425.

［2］Julius S，Kjeldsen S E，Weber M，et al. Outcones in Hypertensive Patients at High Cardiovascular Risk Treated with Regimens Based on Valsartan or Amlodipine：The VALUE Randomized Trial［J］. Lancet，2004，363（9426）：2022 -2031.

［3］赖可，晁若冰，李楠，等. HPLC测定复方氨氯地平胶囊的含量［J］. 华西药学杂志，2010，25（6）：748 - 749.

［4］Rahman N，Singh M，Hoda M N. Application of Oxidants to the Spectrophotometric Determination of Amlodipine Besylate in Pharmaceutical Formulations［J］. Ⅱ Farmaco，2004，59（11）：913 - 919.

［5］胡在林. 反相高效液相色谱法测定苯磺酸氨氯地平胶囊的含量和有关物质［J］. 中国药业，2011，20（12）：28 - 29.

［6］李志伟，赵云超，齐建敏. 高效毛细管电泳法测定缬沙坦苯磺酸氨氯地平［J］. 河北大学学报：自然科学版，2012，32（2）：149 - 153.

［7］王悦.苯磺酸氨氯地平分散片健康人体药动学和相对生物利用度研究［D］. 郑州：郑州大学，2007.

［8］Han M，Kane R，Goto M，et al. Discriminate Surface Molecular Recognition Sites on a Microporous Substrate：A New Approach［J］. Macromolecules，2003，36（12）：4472 - 4477.

［9］Iberer G，Hahn R，Jungbauer A. Monoliths as Stationary Phases for Separating Biopolymers：Fourth-Generation Chromatography Sorbents［J］. LC GC，1999，17（11）：998 - 1005.

［10］Ma Yue，Zhang Ying，Zhao Man，et al. Eff i cient Synthesis of Narrowly Dispersed Molecularly Imprinted Polymer Microspheres with Multiple Stimuli-Responsive Template Binding Properties in Aqueous Media［J］. Chem Commun，2012（48）： 6217 - 6219.

［11］Poole C F. New Trends in Solid-Phase Extraction［J］. TrAC Trends Anal Chem，2003，22（6）：362 - 373.

［12］Pichon V，Haupt K. Affinity Separations on Molecularly Imprinted Polymers with Special Emphasis on Solid Phase Extraction［J］. J Liq Chromatogr Related Technol，2006，29（7/8）：989 - 1023.

［13］黄红萍，游勇基. 分子印迹固相萃取-液相色谱法测定喘息灵胶囊中盐酸克仑特罗的含量［J］. 药物分析杂志，2012，32（2）：233 - 236.