紫外分光光度法测定酪氨酸手性固定相键合量

曹月林，彭奇均

(江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡 214122)

配体交换色谱是最为简便有效的拆分DL-氨基酸方法，其中手性固定相起着至关重要的作用。氨基酸作为廉价易得的手性配体，常用于配体交换手性固定相的合成。自 Dovankov与 Gübitz［1］建立发展配体交换色谱以来，不同氨基酸配体交换手性固定相时有报道，如 L-脯氨酸固定相［2-4］、L-苯丙氨酸固定相［5-6］、L-羟脯氨酸固定相［7-8］。氨基酸配体在固定相中的含量影响固定相的分离效果，与配体结合能力较强的待分离物应选择配体键合量少的固定相，与配体结合能力弱的待分离物应选择配体键合量高的固定相［9］。氨基酸亦可用于分离其他手性化合物的固定相合成［10］。

在前人的研究中，配体键合量的测定均采用元素分析法［3-10］，但元素分析仪器要求高，普通实验室受仪器制约。可代替元素分析法使用的键合量测定方法仍未检索到。

氨基酸中含有氮元素，氮含量的测定方法较多，如凯氏定氮法［11］、紫外分光光度法［12］等。凯氏定氮法操作繁琐，需要特定的消解瓶，耗时，耗电，释放SO2有害气体;紫外分光光度法操作简单，普通紫外分光光度计和比色管即可，方便快捷。本文建立了紫外分光光度法测定酪氨酸手性固定相键合量的新方法，测定了酪氨酸手性固定相键合量，并与元素分析法进行比较，该方法准确可靠，为氨基酸手性固定相键合量的测定提供了一种新的参考方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

KH-560键合硅胶(38 μm)、酪氨酸手性固定相(38 μm)均为自制;过硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钠、氯化镁、氯化钙、碳酸钠、硅酸钠均为分析纯。

TU-1901紫外分光光度计;VARIOEL III元素分析仪;MLS-3750高压蒸汽灭菌器;AL204电子分析天平。

1.2 实验原理

氨基酸手性固定相的基质是硅胶，其化学组成为SiO2，不溶于水，但可与强碱反应［13］。手性固定相以氢氧化钠溶液溶解，氨基酸配体游离到溶液中，120～124℃，配体中的有机氮被碱性过硫酸钾消化为硝酸盐［12］，见图1。

图1 键合量测定示意图Fig.1 Scheme of ligand content determination process

1.3 溶液配制

1.3.1 硝酸根标准溶液 按中华人民共和国环境保护标准 HJ 636—2012规定方法配制10 μg/mL(以氮计)硝酸根标准溶液。

1.3.2 样品待测液的制备 准确称取酪氨酸手性固定相0.1 g于10 mL比色管中，加入2 mL 0.6～1.0 mol/L NaOH溶液，55～75℃水浴至固定相全部溶解，冷却，稀释至刻度。

1.3.3 消化液的制备 取1.0～2.0 mL样品待测液于25 mL比色管中，按中华人民共和国环境保护标准 HJ 636—2012规定方法进行消化，稀释至25 mL。

1.4 硝酸根标准曲线的绘制

按中华人民共和国环境保护标准 HJ 636—2012规定方法进行绘制，见图2。

图2 硝酸根标准曲线Fig.2 Standard curve of nitrate ion

1.5 实验方法

取消化液 5 mL于 25 mL比色管中，加入3 mL 1 mol/L氯化镁(氯化钙)，摇匀，加水稀释至10 mL，静置 60 min。取上清液于带孔径 ＜0.45 μm的针式过滤头的一次性注射器中，将滤液过滤至10 mm比色皿中。以水为参比，测定275，220 nm下吸光度［12］，校正吸光度 A=A220－2A275。同时设置KH-560键合硅胶为空白。按下式计算:

式中 cN——扣除空白后的A带入线性方程计算硝态氮浓度，μg/mL;

V——溶液稀释体积，mL;

n——氨基酸分子中氮原子个数;

m固——固定相样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 固定相溶解条件的确定

取0.1 g酪氨酸手性固定相于10 mL不同浓度的氢氧化钠溶液中，不同水浴温度下溶解，至完全溶解的时间见表1。

表1 不同氢氧化钠浓度和溶解温度下固定相溶解时间Table 1 Dissolved times of CSP in sodium hydroxide with different concentrations at different temperatures

由表1可知，同一温度下，氢氧化钠浓度不影响溶解时间，随温度升高，溶解时间缩短，95℃需2.5 min，75 ℃需4.5 min，55 ℃需16 min。95 ℃时水浴温度高，不易控制，75℃水浴条件相对温和且固定相可快速溶解。

取10 mL不同浓度的氢氧化钠溶液，准确加入0.1 g固定相，75℃水浴溶解，待溶解后继续加入，至不再溶解，加至2 g，冷却，过滤，烘干称重，计算溶解度，结果见表2。

表2 不同浓度氢氧化钠溶液中固定相溶解度Table 2 Solubility of CSP in sodium hydroxide with different concentrations

由表2可知，固定相溶解度与氢氧化钠浓度呈正相关，氢氧化钠浓度在0.4～1.0 mol/L，浓度每增加0.2 mol/L，溶解度增加约3.7 g，固定相溶解的实质是基质中的二氧化硅与氢氧化钠的反应，氢氧化钠总量决定了固定相溶解量。实际溶解过程中，取0.1 g固定相，加入2 mL 浓度0.6 ～1.0 mol/L 氢氧化钠溶液，即固液比为1∶20(m∶V)，可保证固定相全部溶解。确定溶解条件为:氢氧化钠浓度0.6～1.0 mol/L，75 ℃，固液比1∶20(m∶V)。

2.2 测定条件的确定

2.2.1 干扰物的确定 过硫酸钾将有机氮转化为硝态氮，有机碳被转化为碳酸根［14］，同时体系中含有硅酸根。硝态氮在 220，275 nm双波长下测定［12］，结果见图 3。

图3 紫外光谱Fig.3 UV spectrograms

由图3可知，硅酸根、碳酸根在220 nm处产生干扰，使测定结果偏大。测定时应除去硅酸根和碳酸根。硅酸根和碳酸根的镁盐、钙盐是难溶或微溶于水的沉淀［13］，沉淀法可有效除去硅酸根和碳酸根。沉淀剂应在220 nm和275 nm处无吸收。由紫外光谱可知，氯化镁和氯化钙是良好的沉淀剂。

2.2.2 过滤介质的影响 取适量固定相消化液于25 mL比色管中，加入沉淀剂，分别以滤纸和针式滤头(0.8，0.45，0.22 μm)过滤，测定 220，275 nm 吸光度，结果见表3。

表3 过滤介质的影响Table 3 Influence of filter media

由表3可知，滤纸和0.8 μm针式过滤头孔径过大，无法除去细小沉淀颗粒，使A220、A275大于沉淀前。针式过滤头孔径小于0.45 μm，275 nm处基本无吸收，A220趋于稳定。过滤时应取孔径＜0.45 μm的针式过滤头过滤。

2.2.3 静置时间的影响 取5 mL消化液，加入5 mL 1 mol/L的沉淀剂，结果见图4。

图4 静置时间的影响Fig.4 Influence of quiescence time

由图4可知，氯化镁作为沉淀剂，需静置至少60 min。硅酸镁难溶于水［13］，直接以沉淀形式析出。碳酸镁微溶于水［13］，在水中其水解成难溶的氢氧化镁［15］:

静置过程不仅使沉淀沉降便于过滤，同时使碳酸镁水解成氢氧化镁，测定结果更加准确。氯化钙作为沉淀剂，无需静置，硅酸钙、碳酸钙均难溶于水［13］，以沉淀形式析出。但实际操作中，不静置直接过滤，滤头堵塞，过滤困难，静置60 min使沉淀沉降是必要的。

2.2.4 沉淀剂加入量的影响 在前述确定的条件基础上，取5 mL消化液，加入1～5 mL浓度1 mol/L的沉淀剂，结果见图5。

图5 沉淀剂用量的影响Fig.5 Influence of precipitating agent dosage

由图5可知，氯化镁和氯化钙用量小于3 mL，干扰物排除不完全，校正吸光度偏大;≥3 mL后，硅酸根、碳酸根被完全沉淀，校正吸光度趋于稳定。同时，实验中发现，由于消化液中存在由过硫酸钾转化的硫酸根［12］，氯化钙加入量过多，生成微溶的硫酸钙，沉淀量增加，易堵塞滤头，难以过滤。以氯化钙为沉淀剂，加入量以3 mL为宜。

2.3 酪氨酸固定相样品键合量测定

2.3.1 方法精密度及加标回收率 取样品待测液1.0 ～2.0 mL，按实验方法进行测定，结果见表4。

表4 精密度实验结果Table 4 Reproducibility of determination of ligand content

由表 4可知，固定相溶液取样量在 1.0～2.0 mL，多次测定结果的相对标准偏差(RSD)均＜2%，证明本方法的精密度较高。

分别取同一酪氨酸固定相样品待测液1 mL于25 mL比色管中，加入0～3 mL 10 μg/mL NO3－标准溶液，测定本底量和加标测出量，以硝态氮含量计，计算加标回收率，结果见表5。

表5 加标回收率Table 5 Results of recovery

由表5可知，加标回收率在98.0% ～104%，说明该方法可靠，测定准确度较高。

2.4 对比实验

分别采用紫外分光光度法和元素分析法测定酪氨酸固定相键合量。元素分析法在CHNS模式(炉1:1 150℃，炉2:850℃)下进行，按下式计算键合量(μmol/g)，结果见表 6。

式中 N键合硅胶——KH-560键合硅胶氮百分含量，%;

N固——固定相样品氮百分含量，%;

n——氨基酸分子中氮原子个数。

表6 两种方法测定结果比较Table 6 Comparison of the measurement results of the two methods

由表6可知，两种方法均能准确测定酪氨酸手性固定相键合量，元素分析法与紫外分光光度法相对误差3.7%，结果相近。紫外分光光度法可作为元素分析法的替代和补充方法使用。

3 结论

(1)建立了一种紫外分光光度法测定氨基酸手性固定相键合量的新方法。以此方法测得自制酪氨酸手性固定相配体含量为161 μmol/g，RSD＜2%，加标回收率在98.0% ～104%，与元素分析法相对误差3.7%，说明该方法准确可靠。该方法降低了仪器要求，具有较高的广泛性与普遍性。

(2)该方法的实质是测定氨基酸配体中的氮元素，亦可用于测定其他氨基酸配体的手性固定相键合量，具有一定的通用性。该方法提供了元素分析法之外新的参考方法，具有重要的实用价值。

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