浊点萃取-比值导数光度法同时测定水中孔雀石绿和结晶紫

李秋，李贵荣，刘长鹤，韩倩

(南华大学公共卫生学院，湖南衡阳 421001)

孔雀石绿(MG)和结晶紫(CV)同属于碱性三苯甲烷类染料，具有类似结构，在水产养殖、保鲜和运输过程中，作为杀菌剂和抗寄生虫药，用于鱼类水霉病、烂鳃病、寄生虫的防治及原生动物感染等［1-2］。由于孔雀石绿和结晶紫对人畜具有潜在的致畸、致癌和致突变作用［3-4］，20世纪90年代以来世界各国陆续将其列为水产养殖的禁用药物。但由于孔雀石绿和结晶紫价格低廉，而且抗菌效果较好，在水产养殖中仍被部分养殖户使用，现已成为影响食品安全的热点问题。

目前，国内外检测孔雀石绿和结晶紫及其残留的方法主要有:液相色谱-线性离子阱质谱法［5］、分子印迹固相萃取高效液相色谱法［6］、超高效液相色谱-串联质谱法［7］。上述方法所需仪器昂贵，操作条件严格，样品处理复杂，应用受到限制。

本文将浊点萃取和比值导数两种技术相结合，建立一种新的浊点萃取-比值导数光度法，用于不经分离同时测定水样中孔雀石绿和结晶紫。方法无需昂贵仪器，操作方便，样品处理简单，易于普及应用，测定结果的准确度和灵敏度满意。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

孔雀石绿、结晶紫、盐酸、邻苯二甲酸氢钾等试剂均为分析纯;TritonX-114纯度为100%;实验用水均为超纯水。

UV-2550紫外-可见分光光度计;PB-21酸度计;AB204-S电子分析天平;SHHW.21-电热恒温三用水箱;TD5K-Ⅲ低速离心机。

1.2 比值导数光度法原理

若a和b二组分混合溶液，在某波长区吸光度具有加和性，即:

对式(2)求微分，得导数比值光谱。

式(4)可作为组分a定量分析依据。同理，可推导b组分的定量分析依据。

1.3 实验方法

1.3.1 浊点萃取 在10 mL的离心管中依次加入pH 2.8邻苯二甲酸氢钾缓冲液1.5 mL，一定量孔雀石绿(或结晶紫)标准工作液，浓度5%的TritonX-114溶液1.2 mL，用蒸馏水定容至10 mL刻度线，摇匀，放入50℃恒温水浴箱中15 min，溶液变浑浊，取出。以4 000 r/min离心5 min，上层水相弃去。加入无水乙醇，溶解底层孔雀石绿(或结晶紫)富集相并稀释到0.5 mL。

1.3.2 比值导数光谱 将上述溶液转入微型吸收池中，用紫外-可见分光光度计测定400～700 nm波长范围吸收光谱，并应用数据处理软件处理，得到比值吸收光谱和导数比值吸收光谱。选择639，476 nm波长分别为孔雀石绿和结晶紫的测定波长，以该两波长处的导数比值光谱吸收值分别对孔雀石绿和结晶紫浓度绘制标准曲线，采用标准曲线法测定样品中孔雀石绿和结晶紫的含量。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

图1是在表面活性剂富集相中孔雀石绿和/或结晶紫的吸收光谱图。

图1 吸收光谱Fig.1 The absorption spectra

由图1可知，孔雀石绿吸收峰位于624 nm处 ，结晶紫吸收峰位于593 nm处，二者的吸收光谱存在严重的相互重叠。应用比值导数法可以消除两者之间的干扰，则可在两者物质共存的情况下，对两者直接进行测定。

2.2 比值吸收光谱和比值导数光谱及测量波长的选择

按照比值导数光谱的原理，以浓度为8.0×10－6mol/L CV溶液的吸收光谱为除数因子，对二者混合溶液的吸收光谱进行比值-微分处理(以消除共存结晶紫的干扰)，得到孔雀石绿的比值光谱和比值一阶导数光谱，见图2。

图2 孔雀石绿的比值光谱(a)和比值一阶导数光谱(b)Fig.2 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of MG(1～8MG:0.1～10×10－6mol/L)

由图2可知，该比值导数光谱中440，639 nm波长处的导数值均与孔雀石绿的浓度成比例。根据加标回收率等相关指标，选择639 nm作为孔雀石绿的测量波长。

以浓度为6.0×10－6mol/L MG溶液的吸收光谱为除数因子，求得结晶紫的比值光谱和一阶比值导数光谱，见图3。同理，根据图3可选择476 nm作为结晶紫的测量波长。

图3 结晶紫的比值光谱(a)和比值一阶导数光谱(b)Fig.3 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of CV(1～8CV:0.1～10×10－6mol/L)

2.3 实验条件的优化

2.3.1 缓冲溶液及pH值的选择 实验了柠檬酸钠-盐酸、柠檬酸钠-柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、甘氨酸-盐酸、B-R缓冲液对萃取效率的影响。结果表明，邻苯二甲酸氢钾-盐酸溶液的萃取效率最高。因此，选择了邻苯二甲酸氢钾-盐酸作为该体系的缓冲液。pH值对体系萃取效率的影响，见图4。

图4 pH值对体系(孔雀石绿和结晶紫)吸收值的影响Fig.4 The effect of pH value of the system(MG+CV)

由图4可知，当pH＜2.8时，随着pH值增大，孔雀石绿和结晶紫的吸收值增大，当pH＞2.8后，吸收值反而减小。因此，选择pH为2.8。

邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲溶液pH为2.8，考察缓冲溶液用量对浊点萃取效率的影响，结果见图5。

图5 缓冲液用量对MG和CV混合物体系吸光度的影响Fig.5 The effect of buffer solutions volumes on the system(MG+CV)

由图5可知，缓冲溶液用量在1.5 mL时，吸光度值较高。所以，选择缓冲溶液用量为1.5 mL。

2.3.2 表面活性剂及用量的选择 采用TritonX-114、TritonX-100和吐温-80三种表面活性剂，结果表明，TritonX-114的萃取效率最高。如图6显示，对孔雀石绿和结晶紫的混合溶液萃取后测定，TritonX-114的用量为1.2 mL时，吸收值达到了最大值。说明萃取率最好，故选择TritonX-114的用量为1.2 mL。

图6 TritonX-114用量对孔雀石绿和结晶紫混合溶液吸光度的影响Fig.6 The effect of TritonX-114 solutions volumes on the system(MG+CV)

2.3.3 萃取温度和平衡时间的选择 考察了水浴温度30～75℃ 和平衡时间5～40 min对体系吸光度的影响。实验表明，水浴温度为50℃ 时，吸光度达到最大值，说明萃取效率最好。随着萃取平衡时间的增长，富胶束相萃取率越高吸光度越大，15 min即可萃取完全。故本萃取实验选择温度为50℃，水浴中加热15 min。

2.4 方法的检出限和线性范围

2.4.1 除数因子的选择 实验选择了不同浓度的孔雀石绿或结晶紫标准溶液作为除数因子，比较所绘制的标准曲线的线性范围、斜率和相关系数，并选择最佳的结果，以提高测定的准确度和灵敏度。实验结果表明，选用浓度为8.0×10－6mol/L的MG和6.0×10－6mol/L的CV作为除数因子时，分析方法的相关指标较好。

2.4.2 方法的检出限和线性范围 在优化的条件下，取不同量的孔雀石绿和/或结晶紫标准溶液，按照实验方法的步骤，求得回归方程分别为:

实验结果表明，孔雀石绿和结晶紫在1.0×10－8～1.0×10－6mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限分别为 3.93 ×10－9，4.96 ×10－9mol/L。在线性范围内，配制高中低3组浓度的标准溶液进行精密度实验(n=6)，孔雀石绿的相对标准偏差分别为 4.08%，3.89%，1.22%，结晶紫的相对标准偏差分别为 4.31%，3.85%，3.39%。

由于浊点萃取前总体积为10 mL，预富集后总体积为0.5 mL，所以富集倍率为20倍。

2.5 共存离子的干扰实验

以孔雀石绿和结晶紫的混合溶液(MG和CV浓度均为4.0×10－7mol/L)进行干扰实验，考察了常见离子及有机物对测定的影响。当相对误差控制小于±5% 时(以倍计)，实验结果见表1。

表1 常见离子及有机物的干扰实验结果Table 1 Interfere with test result of common ions and organics

2.6 样品的处理和测定

池塘水经离心分离后，取上清液，在最佳条件下测定，重复5次，结果见表2。

表2 水样测定结果(n=5)Table 2 The determination results of water samples

由表2可知，孔雀石绿和结晶紫在样品中加标回收率分别为 96.6% ～104.0% 和 98.5% ～110.0%。

3 结论

本实验结合浊点萃取和比值导数两种技术，建立了一种浊点萃取-比值导数分光光度新方法，实现了不经分离同时检测环境水样中的孔雀石绿和结晶紫含量的一种。该方法简单、安全、无污染、灵敏度高，用于测定实际样品，结果令人满意。

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