双水相提取鱼肉中的有机氯农药残留

李慧芳

(烟台大学文经学院，山东烟台 264005)

有机氯农药(OCPs)是一类由碳氢氯构成的有机化合物(有的种类含硫元素)，具有显著的杀虫效果，并对恶性传染病的控制、农林病害的防治等起着非常重要的作用。但由于OCPs为持久性污染物，难于降解，能通过食物链富集于生物体内，故可威胁到食品安全。鱼肉作为人类膳食中蛋白质的重要来源，控制其中的OCPs残留水平对人体健康至关重要。目前，鱼肉中OCPs残留分析的样品前处理方法主要包括固相萃取［1］、固相微萃取［2］、基质固相分散技术［3］、凝胶渗透色谱法［4］、微波消解法［5］等。但是通过实践发现，上述方法存在操作繁琐、耗时、成本高、劳动强度大、试剂用量大、环境污染严重等问题，而且提取净化能力不强。

双水相萃取技术是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取。该技术已被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，可对细胞、膜、病毒、蛋白质、核酸以及其他天然药物有效成分进行分离和提纯［6-15］。然而，传统以高聚物-高聚物或高聚物-盐所形成的双水相体系，由于粘度太大，会干扰萃取结果，而且成本过高，经济上不具优势。所以，需要开发新型的双水相体系，这也成为双水相萃取研究的热点。

研究表明，无机盐、水与乙腈［16-19］、异丙醇［10-20］、丙酮和乙醇［20］等水溶性有机溶剂以适当比例混合时，也能分成两相。这种新型的双水相体系具有操作简单、对分析物无干扰，试剂低毒、低粘度，传质和分相速度快等优点，并已成功的应用于多种金属离子的萃取分析［21-25］。因此，利用OCPs在这种新型双水相体系中具有较大的分配系数，来实现鱼肉中有机氯农药残留的高效提取具有重要意义，而目前还未见有这方面的报道。本研究旨在利用乙腈-无机盐-水双水相体系来提取净化鱼肉中的OCPs残留，建立鱼肉中OCPs残留分析的样品前处理新方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

α-BHC、β-BHC、δ-BHC、o，p-DDE、p，p-DDE、o，p-DDD、p，p-DDD、o，p-DDT、p，p-DDT 等 9 种 OCPs均购自 Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度在 97.0% ～99.0%;cleanert C18和 PSA(20 ～40 μm);所有溶剂均为色谱级。

岛津GC2010气相色谱仪(配有ECD检测器);OL-861漩涡振荡器;Hitachi 20PR-520制冷高速离心机;UPWS-超纯水系统。

1.2 色谱分析条件

色谱柱为DB-1毛细管柱;载气为氮气，流速1.0 mL/min;进样口温度 200℃;检测器温度320℃;进样量1 μL，进样方式为分流进样，分流比15∶1;初始温度 150 ℃，保持 2 min，6 ℃/min→270℃，保持8 min。

1.3 试液的配制

9种有机氯标准物质分别称取1 mg于10 mL容量瓶中，正己烷定容，作为混标储备液，于－20℃保存备用。然后配制浓度为 100，50，20，10 μg/kg标准工作液。

1.4 双水相体系的制备

10 mL比色管中加入适量无机盐、5 mL水和适量乙腈，然后加入9种OCPs混标，漩涡1～2 min，室温下静置，待溶液分层后，气相色谱进样检测。然后计算体系的相比、富集因子以及OCPs的萃取率。

1.5 鱼肉样品前处理

称取已匀浆的鲤鱼脊背肉2.5 g，依次加入5 mL水和4 mL乙腈，漩涡1 min后加入2.0 g醋酸钾，漩涡1 min，然后3 500 r/min离心10 min。将上相清液转移至另一离心管中，分别加入1 g无水硫酸镁和 0.1 g PSA固体颗粒，漩涡 1 min后3 500 r/min离心10 min，取上清液，气相色谱进样检测。

1.6 国标方法测定鱼肉中OCPs农药残留

参考国标方法［4］，对鱼肉中9种OCPs残留进行了检测。

2 结果与讨论

2.1 双水相体系的制备

2.1.1 无机盐的选择 双水相是由亲水性有机溶剂、无机盐、水组成的两相体系，我们选取了钾盐、钠盐、铵盐作为研究对象，根据文献报道［16-19］，这几类常见的无机盐与水、乙腈形成双水相时，分相能力大小顺序为:KC2H3O2＞ K2CO3＞KF＞KBr;(NH4)2SO4＞Na2CO3＞Na3C6H5O7＞Na2S2O3＞Na2SO4，据 此 首 先 筛 选 了 KC2H3O2、K2HPO4、K2CO3、Na2CO3、NaC2H3O2和(NH4)2SO4这 6 种无机盐。但是通过实际操作发现，六六六在K2CO3和Na2CO3与水、乙腈形成的双水相中会发生降解，故这两种体系不适于分析OCPs残留。实验最终选择KC2H3O2、K2HPO4、NaC2H3O2和(NH4)2SO4这 4 种盐分别与乙腈、水形成双水相。

2.1.2 无机盐含量对相平衡产生的影响 我们分别研究了4种双水相体系中无机盐含量对富集因子(F=V水/V上相)和相比(R=V上相/V下相)的影响。

图1 盐含量对富集因子的影响Fig.1 Effect of the amount of salt on enrichment factor

由图1可知，固定体系中加入5.0 mL水和2 mL乙 腈，当 NaC2H3O2、(NH4)2SO4、K2HPO4和KC2H3O2四种盐含量分别为 2.0 ～2.5 g，1.0 ～2.3 g，1.3 ～2.0 g和2.0 ～3.0 g时，富集因子 F 分别稳定在9，3，3和5左右。

图2 盐含量对相比的影响Fig.2 Effect of the amount of salt on the phase-volume ratio

由图2可知，当体系中水和乙腈体积保持不变时，相比会随着盐用量先快速增大，后缓慢减小。所以结合图1和图2，必须同时考虑富集因子和相比对双水相体系萃取OCPs的影响。

2.1.3 无机盐含量对OCPs萃取率的影响 由于高的富集因子和低的相比有利于药物的富集，所以我们比较了不同盐含量的双水相体系对OCPs萃取率的大小。固定体系中加入5.0 mL水、2 mL乙腈和 0.05 μg OCPs，当 NaC2H3O2、(NH4)2SO4、K2HPO4和 KC2H3O2的含量分别为 1.5 ～2.5 g，0.5～2.3 g，1.0 ～2.0 g和 1.0 ～3.0 g时，各体系对 9种OCPs的萃取率大小见图3中a～d所示。结果发现，K2HPO4-CH3CN-H2O体系对α-BHC和o，p-DDT萃取率均偏低;而NaC2H3O2-CH3CN-H2O体系在分相后，上相体积太小，不便于实际样品的检测;其余两种盐(NH4)2SO4和KC2H3O2，使用一定的量与乙腈、水组成双水相体系，对9种OCPs的萃取不但高效而且稳定。

图3 不同盐含量的双水相体系对9种OCPs的萃取率Fig.3 Extraction efficiency of 9 OCPs in acetonitrile-salt-H2O with different amount of salt

2.1.4 乙腈含量对富集因子和OCPs萃取率的影响 根据2.1.2节和2.1.3节讨论，固定各双水相体系中水含量为5 mL，醋酸钾和硫酸铵的含量分别为1.6 g和1.5 g，比较乙腈含量对体系富集因子及OCPs萃取率的影响，结果见表1和表2。

由表1、表2可知，随着乙腈含量的增加，两种体系的富集因子均明显下降，而OCPs萃取率却是缓慢升高后趋于平衡。由于高的萃取率和合适的富集因子是痕量分析的关键，结合此两种因素，并且考虑到实际操作可行性，发现醋酸钾-乙腈-水体系不但萃取率高，而且富集效果明显优于硫酸铵-乙腈-水体系，所以最终选择乙腈、醋酸钾、水配比为2.0～3.0 mL ∶1.6～2.1 g ∶5 mL 的双水相体系来萃取OCPs。

表1 乙腈-醋酸钾-水体系中乙腈含量对OCPs萃取率的影响Table 1 Effect of the volume of acetonitrile on extraction efficiencies of 9 OCPs in CH3CN-KC2H3O2-H2O

表2 乙腈-硫酸铵-水体系中乙腈体积对OCPs萃取率的影响Table 2 Effect of the volume of acetonitrile on extraction efficiencies of 9 OCPs in CH3CN-(NH4)2SO4-H2O

2.1.5 温度对OCPs萃取率的影响 实验研究了不同温度下，乙腈-醋酸钾-水体系对OCPs萃取率的大小，结果见图4(以 α-BHC、o，p-DDD、o，p-DDE、o，p-DDT和p，p-DDT这5种OCPs为例)。

图4 温度对OCPs萃取率的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiencies of OCPs

由图4可知，当温度低于20℃时，不同极性的OCPs萃取率均有不同程度的下降;当温度介于20～40℃时，萃取率稳定在80%以上;当温度大于40℃时，极性小的OCPs萃取率有所增大，极性大的却呈下降趋势。综合各种因素，实验最佳操作温度应为20～30℃。

综上所述，配比 2.0 ～3.0 mL ∶1.6 ～2.1 g ∶5 mL的乙腈-醋酸钾-水双水相体系在室温下萃取9种OCPs的效果相对最好，可用于鱼肉中OCPs残留分析的样品前处理中。

2.2 净化剂的选择

由于鱼肉基质杂质较多，若要分析其中的OCPs残留，在双水相萃取净化的基础上，还需要加入有效的净化剂。根据文献报道［26］，实验筛选了2种净化效果较好的PSA和C18作吸附剂、硫酸镁作干燥剂，研究2种净化剂对OCPs的吸附作用，结果见表3(以 α-BHC、o，p-DDD、o，p-DDE、o，p-DDT 和 p，p-DDT这5种OCPs为例)。

表3 吸附剂对OCPs回收率的影响Table 3 Effect of sorbents on recoveries of OCPs

由表3可知，PSA和硫酸镁对有机氯农药的吸附作用很小，基本可忽略不计，而C18对极性大的p，p-DDT有较强的吸附，会对萃取结果造成很大影响。故针对鱼肉中的OCPs残留，以乙腈-水-醋酸钾体系作提取剂时，应使用PSA和硫酸镁作为净化剂。

2.3 标准曲线和检测限

将所配制的系列浓度混合标准溶液，经GC测定。各药物检测限为3倍基线噪音对应的浓度。9种OCPs的保留时间、回归方程(y为峰面积，x为质量浓度，μg/kg)、相关系数以及检测限见表4。

表4 9种OCPs的保留时间、回归方程、相关系数和检测限Table 4 Retention time，regression equations，correlation coefficients and detection limits for the determination of OCPs

2.4 样品测定

考虑到鱼肉中的水分含量，实验选择了适当配比的乙腈-醋酸钾-水双水相体系结合分散固相萃取法，来提取鱼肉中不同添加水平的OCPs残留，并与国标法作了比较(见表5)。9种OCPs加标样品色谱图，见图5。

结果证明，双水相体系结合分散固相萃取净化的前处理方法效果很好，不仅可以将提取、基质去除与净化一次完成，而且9种药物提取回收率可达78% ～106%，相对标准偏差均小于11%，和国标法相比有了很大提高。

表5 鱼肉中9种OCPs添加回收率及精密度Table 5 The recoveries of 9 OCPs in fish by different pretreatment methods(n=4)

图5 浓度为50 μg/kg的鱼肉加标样品色谱图Fig.5 GC chromatogram of fish samples at a fortified level at 50 μg/kg

3 结论

室温下一定配比的乙腈-醋酸钾-水体系对OCPs萃取率不但高效而且稳定，由此建立了一种全新的样品前处理技术，即以乙腈-醋酸钾-水双水相体系为提取剂，以PSA颗粒为吸附剂，无水硫酸镁为干燥剂，经离心分离去基质后，气相色谱直接进样分析的方法来提取测定鱼肉样品中的9种OCPs残留。该方法操作简单、耗时少，不仅有很好的净化效果，而且提取回收率较高，明显优于国标法，完全能够满足鱼肉中OCPs残留的即时高效检测。

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