ASIC1a对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响

张礼菊，胡 伟，唐 杰，吴繁荣，葛金芳，陈飞虎，吴建贤

酸敏感离子通道（acid-sesing ion channels，ASICs）是一类由胞外酸化后被H＋激活的阳离子通道，ASICs通道开放可导致胞外 Na＋、Ca2＋内流，并激发各种病理生理效应。其中，ASIC1a亚基因介导Ca2＋内流，并具有广泛的生物学功能和重要的病理学意义，成为研究的热点［1－2］。Xiong等［3］用特异性阻滞剂Psalmotoxin-1（PcTx-1）阻断ASIC1a，发现其不仅特异性阻断由ASIC1a介导的电流，而且能特异性抑制细胞内Ca2＋的超载，使脑缺血病灶模型的梗死体积明显减小，敲除ASIC1a基因或用ASIC1a阻滞剂都可以保护缺血性脑损伤。本课题组前期研究证实，ASICs非特异性阻滞剂Amiloride通过阻断酸敏感离子通道减轻关节炎大鼠关节软骨破坏，发挥关节软骨保护作用［4］，但具体机制不清。

软骨是关节内覆盖骨骼末端的无血管组织，由于低氧和缺血导致软骨处于一种偏酸性的生理状态。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成。软骨细胞仅占软骨组织体积的3%，其主要功能是通过分泌II型胶原（主要成分为羟脯氨酸hydroxyproline，Hyp）、蛋白多糖（主要成分为糖胺聚糖glycosaminoglycan，GAG）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinas，MMPs）和金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinas，TIMPs），维持关节软骨的完整性和功能性。软骨基质的合成以及酶与酶抑制剂之间保持动态平衡，调节软骨ECM的产生和破坏，以维持软骨正常的代谢和功能。在关节炎的病理状态下，由于软骨细胞的无氧糖酵解以及关节细胞产生的炎症因子，导致软骨微环境进一步酸化，局部组织pH值最低可达6.0左右，胞外酸化对软骨细胞基质代谢具有重要的影响［5－6］。那么，这种酸化对软骨细胞代谢作用是如何发生的，是否与人体存在的酸感受器ASICs有关？

为此，本研究以大鼠关节软骨细胞为试验对象，从细胞和分子水平深入开展ASIC1a对大鼠关节软骨细胞基质代谢以及细胞内MAPK信号通路表达的影响。旨在进一步探索ASIC1a在关节软骨细胞功能和代谢中的作用，初步阐明阻断ASIC1a对大鼠关节软骨保护的细胞和分子机制，以丰富人们对ASIC1a功能的认识，为关节炎的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，体质量（160±20）g；由安徽医科大学实验动物中心提供。合格证号：皖医实动准字第01号。

1.2 药物与试剂 RNA引物，由上海生工生物有限公司合成；Lipofectamine 2000通用转染试剂盒，Invitrogen公司产品；Syber Green染料，Fermentas公司产品；PcTx1，上海优宁维生物科技有限公司；Amiloride，Sigma公司产品；ASIC1a siRNA，上海吉玛制药技术有限公司；蛋白磷酸酶抑制剂，Roche公司产品；ASIC1a抗体，Santa Cruz公司；p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK（Thr180／Tyr182）（12F8）Antibody，Cell Signaling Technology公司产品；p44／p42 MAPK（ERK1／2）、Phospho-p44／p42 MAPK（ERK1／2）（Thr202／Tyr204）Antibody，CST公司产品；MMP-2、TIMP ELISA试剂盒，美国RD公司；羟脯氨酸标准品、硫酸软骨素标准品，美国Sigma公司产品。

1.3 软骨细胞的分离鉴定 按本实验室常规方法进行大鼠关节软骨细胞的分离［7］，将已经消毒的盖玻片（20 mm2）置于培养皿（90 mm2）中，按 2×107·L－1的密度将软骨细胞接种于培养皿中，5 d后，细胞爬片结束，常规操作，甲苯胺蓝染色，Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨细胞。

1.4 软骨细胞酸化刺激和药物处理 将软骨细胞分组如下：pH 7.4正常组、pH 6.0组、pH 6.0＋Amiloride组（100μmol·L－1）、pH 6.0＋PcTx1组（100μg·L－1）、pH 6.0＋siRNA组。各组于给药30 min后，加入pH 6.0的培养基共培养3 h，换回pH 7.4的正常培养基培养48h，收集上清，检测阻断ASIC1a对酸化引起的基质代谢变化的影响。

其次，MAPK信号通路表达试验，细胞分组如下：pH 7.4正常组、pH 6.0组、pH 6.0＋PcTx1组（100μg· L－1），检测酸化及阻断 ASIC1a对p38MAPK、ERK1／2磷酸化的影响。

1．5 对二甲基亚甲蓝分光法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中GAG的含量［8］收集软骨细胞培养液，3 000 r·min－1离心，取上清液 500μl和 500μl木瓜蛋白酶缓冲液（木瓜蛋白酶20 mg、乙二胺四乙酸584.6 mg、半胱氨酸6 mg，溶于蒸馏水至50 ml体系）混合，55℃消化12 h后，取上清液200μl，加入2.5 ml对二甲基亚甲基蓝溶液（16 mg对二甲基亚甲基蓝、3.04 g甘氨酸、2.37 g氯化钠、95 ml 0.1 mol·L－1HCl加双蒸水至1 L，摇匀，调 pH 3.0），在波长525 nm处用分光光度计比色，读取吸光度值，代入标准曲线，计算软骨细胞培养液中GAG的含量。

1．6 氯胺T法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中Hyp的含量［9］精密吸取2 ml HCl（12 mol·L－1），加到含2 ml培养液的EP管中，110℃水浴12 h（将EP管中4 ml液体转移至安瓿瓶中，拉丝封口），水浴后可见黑色残渣，将滤纸剪成2 cm半径大小，过滤，取滤液 2 ml，配制 12 mol·L－1NaOH溶液，调pH至6.5～7.0（可见培养液酸→中性→碱性），取上面调过pH值的滤液0.5 ml，依次加入2 ml异丙醇和0.5 ml氯胺T试剂（1.27 g氯胺T、50%异丙醇20 ml，加双蒸水稀释至 100 ml，摇匀），25℃放置 25 min，最后加入0.5 ml恩里克试剂（对二甲氨基苯甲醛15 g置于100 ml容量瓶中，用65 ml／35 ml异丙醇／高氯酸（2∶1）定容至100 ml，临用前配制）混匀后，65℃水浴，显色20 min，冷却后，读取560 nm吸光度。将吸光度值代入标准曲线计算软骨细胞培养液中Hyp的含量。

1．7 ELISA法检测大鼠关节软骨细胞培养上清中MMP-2、TIMP-2的含量 从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；样本孔先加待测样本10μl，再加样本稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50μl，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值，绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线。将检测的OD值代入标准曲线，计算软骨细胞培养液中MMP-2、TIMP-2的含量。

1．8 Western blot检测软骨细胞 p38 MAPK和ERK1／2蛋白磷酸化水平 加入pH 6.0的培养基培养3 h后，收集细胞，每瓶加入800μl强RIPA裂解液（含10%PMSF）裂解30 min，吹打将细胞转移到1.5 ml EP管中，离心30 min，取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。蛋白与5×上样缓冲液以4∶1的比例混合，100℃煮10 min变性。蛋白样品进行 SDS-PAGE，电泳分离，经 PVDF膜转移，5%脱脂奶粉封闭3 h，随后加入一抗（1∶500）孵育。TBST洗去多余的一抗，加入相应二抗，孵育，漂洗，ECL发光显影。结果用Image-Pro Plus处理。

1.9 统计学分析 采用SPSS 13.0软件，实验结果均以¯x±s表示，所有统计分析均采用方差分析。各组数据运用单因素方差分析进行统计检验。

2 结果

2.1 软骨细胞的分离鉴定 甲苯胺蓝染色结果显示：大鼠关节软骨细胞爬片经染色后，软骨细胞单层生长，细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色，清晰可见1～2个核仁，细胞外基质为浅蓝色（Fig 1A）。免疫组织化学染色结果显示：大鼠关节软骨细胞胞质被染成棕黄色，细胞相互接触少的地方棕色较淡，细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。表明在培养的大鼠关节软骨细胞和细胞外基质中有Ⅱ型胶原表达，证实本研究中分离并传代培养的细胞为关节软骨细胞（Fig 1B）。

Fig 1 Identification of articular chondrocytes

2．2 ASIC1a对软骨细胞GAG代谢的影响 结果如Fig 2所示，酸化刺激组关节软骨细胞培养液中GAG的含量与正常组比较明显下降（P＜0.01）；与酸化刺激组相比，ASIC1a特异性阻滞剂PcTx1（100 μg·L－1）和 ASIC1a siRNA可明显增加 GAG的含量（P＜0.01）。ASICs非特异性阻滞剂 Amiloride（100μmol·L－1）也可明显增加 GAG的含量（P＜0.01）。

Fig 2 Effect of ASIC1a on GAG levels in acid-induced articular chondrocytes by 1，9-dimethylmethylene blue spectrophotometric（¯x±s，n＝6）

2．3 ASIC1a对软骨细胞Hyp代谢的影响 结果如Fig 3所示，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞培养液中Hyp的含量与正常组比较明显下降（P＜0.01）。与酸化刺激组相比较，ASIC1a特异性阻滞剂PcTx-1（100μg·L－1）和 ASIC1a siRNA可明显增加 pH 6.0组抑制的Hyp含量（P＜0.01），ASICs非特异性阻滞剂 Amiloride（100μmol·L－1）也可明显增加Hyp含量（P＜0.01）。

Fig 3 Effect of ASIC1a on Hyp levels in acid-induced articular chondrocytes by chloramine T method（¯x±s，n＝6）

2．4 ASIC1a对软骨细胞MMP-2和TIMP-2代谢的影响 对于MMP-2，结果如Fig 4所示，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞培养上清中MMP-2的含量与正常组比较明显下降（P＜0.01）。与酸化刺激组相比较，ASIC1a特异性阻滞剂 PcTx-1（100μg·L－1）组MMP-2含量明显增加（P＜0.01），ASIC1a siRNA可增加MMP-2含量（P＜0.05），ASICs非特异性阻滞剂Amiloride（100μmol·L－1）可明显增加MMP-2含量（P＜0.01）。

Fig 4 Effect of ASIC1a on MMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA（¯x±s，n＝6）

对于TIMP-2，结果如Fig 5显示：pH 6.0组大鼠关节软骨细胞培养上清中TIMP-2的含量与正常组比较明显下降（P＜0.01），ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1组（100μg·L－1）和ASIC1a siRNA可明显增加TIMP-2含量（P＜0.01）。ASICs非特异性阻滞剂Amiloride（100μmol·L－1）组可明显增加 TIMP-2含量（P＜0.01）。

2．5 ASIC1a对软骨细胞 p38 MAPK和 ERK1／2磷酸化的影响 对于p38 MAPK，结果见Fig 6所示，酸化刺激大鼠关节软骨细胞3h后，与正常组比较，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞p38 MAPK蛋白磷酸化明显增加，且差异具有显著性（P＜0.01）。与酸化刺激组比较，ASIC1a特异性阻滞剂PcTx-1（100μg·L－1）组明显抑制了酸化刺激大鼠关节软骨细胞p38 MAPK蛋白磷酸化表达（P＜0.01）。

Fig 5 Effect of ASIC1a on TIMP-2 levels in acid-induced articular chondrocytes by ELISA（¯x±s，n＝6）

Fig 6 Analysis of effect of ASIC1a on p38 MAPK phosphorylation in articular chondrocytes（¯x±s，n＝3）

对于ERK1／2，结果如Fig 7所示。酸化刺激大鼠关节软骨细胞3 h后，与正常组比较，酸化刺激组大鼠关节软骨细胞ERK1／2蛋白磷酸化明显增加，且差异具有显著性（P＜0.01）。与酸化组比较，ASIC1a特异性阻滞剂 PcTx-1（100μg·L－1）预处理组明显减少了酸化刺激大鼠关节软骨细胞ERK1／2蛋白的磷酸化（P＜0.01）。

酸化刺激大鼠关节软骨细胞3 h后，大鼠关节软骨细胞检测不到JNK磷酸化蛋白的表达。

3 讨论

Fig 7 Analysis of effect of ASIC1a on ERK1／2 phosphorylation in articular chondrocytes（¯x±s，n＝3）

软骨细胞代谢异常在类风湿关节炎及骨性关节炎关节软骨破坏的病理过程中起关键作用。软骨组织是一种特殊的组织，由单一的软骨细胞和ECM组成，细胞只占软骨组织体积的3%，其余均为主要由Ⅱ型胶原（COII）、蛋白多糖（Acan）和水等组成ECM成分。成熟软骨细胞本身的代谢非常活跃，维持关节软骨的正常代谢，在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。软骨细胞可以合成胶原蛋白与蛋白多糖，以及其它ECM。同时，它还可以分泌多种炎症性细胞因子，亦可产生MMPs和TIMPs。在正常生理状况下，这些细胞因子、酶及酶抑制剂之间保持平衡，调节软骨ECM的产生和降解，以维持正常的代谢和功能。但在关节炎等病理状态下，软骨细胞基质代谢异常，直接导致关节软骨的结构和功能丢失。

组织酸化是导致软骨细胞基质代谢异常的重要原因。软骨细胞对细胞外酸化的应答一方面表现为胶原和蛋白多糖合成的减少，另一方面表现为相对提高MMPs活性，而后者可降低软骨中的Ⅱ型胶原和蛋白多糖。近年的一些研究提示，MMPs几乎能降解所有的细胞外结缔组织基质。在正常情况下，其与TIMPs以1∶1不可逆结合，对MMPs起抑制作用，使ECM始终处于降解速度不快于更新速度。软骨细胞能够感受周围环境的变化而不断调整ECM的代谢活动。适当的pH值会促进关节软骨细胞和胞外基质的代谢，不适当的pH值（pH小于7.0）不仅影响关节软骨细胞的代谢，而且还能诱导分解基质的酶表达和活性，导致软骨ECM的破坏［10］。

ASICs是一类由胞外酸化后被H＋激活的阳离子通道［1］。胞外酸化能激活ASICs各亚基的开放，影响 ASICs的转运，导致细胞进行 Na＋、Ca2＋等离子转运。内流的离子可能通过改变细胞内成分来调控细胞基质的代谢。本文前期研究证实，大鼠关节软骨细胞存在ASIC1a表达，ASIC1a调控胞外酸化刺激的软骨细胞内Ca2＋浓度变化，并影响胞外酸化刺激的关节软骨细胞损伤。本研究发现，ASIC1a调控胞外酸化诱导的软骨细胞MMP-2以及相应的TIMP-2的合成，并影响 GAG、Hyp的代谢和更新。pH 6.0酸化组明显降低软骨细胞培养基中GAG和Hyp的含量，与Wilkins等［11］研究胞外酸化对软骨细胞基质代谢的作用结果相一致。此外，与正常组相比，胞外pH 6.0酸化刺激可使关节软骨细胞MMP-2、TIMP-2含量分别下降51.39%、79.05%，而阻断ASIC1a后，则可使MMP-2、TIMP-2的含量分别恢复至正常含量的71.79%、71.89%，提示ASIC1a激活可导致软骨细胞分泌MMP-2和TIMP-2减少。其中，MMP-2的减少较为缓慢，而TIMP-2的含量则呈现快速下降，从而破坏MMPs和TIMPs间的平衡，导致MMPs含量水平相对增加，关节软骨ECM降解加剧，阻断ASIC1a可通过恢复MMPs和TIMPs的相对平衡，从而保护AA大鼠关节软骨。

ASIC1a属于钙渗透性酸敏感离子通道，胞外酸化激活可介导ASIC1a通道开放，胞外Ca2＋内流，引发一系列生物学效应［12］。而Ca2＋作为细胞内的第二信使在信号传导过程中有极其重要的作用，几乎参与了人体生命的所有活动功能［13］。持续升高的胞质内Ca2＋可以激活下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路，触发信号级联放大，从而控制多种细胞的生物反应［14］。本研究中 Western blot结果表明，胞外酸化刺激的大鼠关节软骨细胞磷酸化状态的ERK1／2和p38 MAPK表达增强，而JNK的磷酸化蛋白无表达，提示MAPK家族中只有ERK1／2和p38 MAPK蛋白参与了ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞信号传导。

综上所述，本研究证实大鼠关节软骨细胞ASIC1a激活，可抑制软骨细胞对基质的合成，导致MMPs与TIMPs的代谢失衡。因此，阻断ASIC1a可通过抑制关节软骨细胞基质代谢失衡，进而增加软骨细胞对基质的合成，减少MMPs对软骨基质的降解，抑制关节软骨的损伤，恢复关节软骨的结构和功能，从而保护关节炎关节软骨。

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