JAK2／STAT3调节抗增殖蛋白表达在H 2 S后处理心肌细胞中的保护作用

毛洪雅，杨洁琼，季 永

硫化氢（Hydrogen sufide，H2S）被认为是继 NO和CO之后发现的第三类新型气体信号分子［1］，在各个系统尤其是心血管系统中发挥着重要的生物学效应。本课题组前期的研究发现，H2S后处理对离体大鼠缺血／再灌注（I／R）损伤的心肌具有保护作用［2］。其保 护机制 与 JAK2／STAT3通路 有 关［3］。抗增殖蛋白（prohibitin，PHB）是一种高度保守的蛋白质。新近的研究发现，该物质对心肌具有保护作用［4－5］，并且磷酸化的 STAT3可以调节 PHB的表达［6］。然而，在外源性硫化氢后处理对心肌的保护作用中，是否通过JAK2／STAT3信号通路调节PHB蛋白而起保护作用尚未见报道。本研究采用原代培养的乳鼠心肌细胞建立缺氧／复氧损伤模型，应用JAK2／STAT3通路抑制剂AG490阻断其通路，观察其对硫化氢后处理心肌保护作用及PHB表达的影响，探讨JAK2／STAT3信号通路是否通过调节抗增殖蛋白而在硫化氢（H2S）后处理中减轻心肌细胞缺氧／复氧损伤。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 DMEM培养基（Hyclone，美国）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；硫氢化钠、AG490（Sigma，美国）；乳酸脱氢酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）；兔抗总STAT3和磷酸化STAT3抗体（CST，美国）；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物公司）；SDS-PAGE凝胶配胶试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BCIP／NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（碧云天，中国）。

1.2 仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；细胞培养箱（美国Thermo公司）；倒置显微镜（日本 Olympus公司）；流式细胞仪（美国 Becton Dickinso公司）；酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养 取出生1～3 d的SD大鼠（徐州医学院动物实验中心提供），参照文献［7］，将左心室剪成1 mm3的小碎块，用0.125%胰酶、0.08%胶原酶I分离、离心收集心肌细胞，制成细胞悬液，接种于培养皿中，放在37℃，5%CO2的培养箱中静置培养90 min，用差速贴壁法去除贴壁细胞，将细胞浓度调至1×109·L－1，同时加入0.1 mmol·L－15-溴脱氧核苷继续培养，隔天换培养液。取培养72 h的心肌细胞进行实验。

1.4 心肌细胞缺氧／复氧模型的制备 参照文献［8］，用高纯氮气（1 L·min－1）饱和30 min，氧分压低于7 kPa的缺氧液置换正常的培养液，然后将此心肌细胞置于含95%N2、5%CO2的密闭容器中，并与密闭容器一同放入培养箱中缺氧2 h，即为缺氧；然后将预先用纯氧饱和30 min的复氧液置换缺氧液，并将此心肌细胞放入含95%空气、5%CO2、37℃培养箱中培养2 h，即为复氧。

1.5 分组与方法 将培养的心肌细胞随机分为6组：①正常对照组（Normal组）：将心肌细胞用复氧液培养4 h；②缺氧／复氧组（H／R组）：心肌细胞缺氧2 h，复氧2 h；③硫化氢后处理组（NP组）：缺氧2 h后，即刻用含10μmol·L－1的 NaHS复氧液培养30 min，后换成不含NaHS的复氧液培养1.5 h；④硫化氢后处理＋AG490组（N＋A组）：缺氧2 h后，用含NaHS和AG490的复氧液培养30 min，后换成不含二者的复氧液继续培养1.5 h；⑤AG490组（AG组）缺氧2h后，给予 10μmol·L－1的AG490复氧液培养30 min，后用无AG490的复氧液继续培养1.5 h；⑥溶媒组（DMSO组）：缺氧2 h后，用含0.1%的DMSO复氧液培养30 min，后用无DMSO的复氧液继续培养1.5 h。分别在缺氧前、复氧2 h检测心肌细胞的存活率、培养液中LDH的释放；复氧末，采用流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡率；Western blot检测t-STAT3、p-STAT3、PHB蛋白的表达情况。

1.6 心肌细胞存活率检测 将心肌细胞按照每孔体积200μl接种至96孔板内培养，按照实验方案处理后，每孔加入20μl的MTT溶液（5 g·L－1），37℃孵育4 h后吸弃上清，每孔加入150μl的DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测各孔的吸光度。细胞存活率／%＝（试验组检测值／对照组检测值）×100%。

1．7 培养液中LDH释放量的检测 分别在缺氧前、复氧2 h收集细胞培养液，按照试剂盒说明书测定上清液中LDH的释放情况。

1.8 细胞凋亡检测 用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况。各组细胞按照实验方案处理后，用胰酶消化并收集各组细胞，加入预冷的PBS液1 ml洗涤2～3次；用200μl的 Binding buffer重悬细胞；将10μl Annexin V-FITC加入细胞悬液中并混匀，避光室温孵育15 min；再加入300μl的Binding buffer和5μl的PI工作液，轻轻混匀并上机检测。细胞凋亡率（%）以早期凋亡细胞（LR）和晚期凋亡细胞（UR）所占比例表示。

1．9 Western blot检测 p-STAT3、t-STAT3、PHB表达水平 按照Folin酚法测定蛋白浓度，配平煮沸5 min，取等量的心肌样本进行SDS-PAGE电泳，分离后将蛋白质转移至PVDF膜上。5%的脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入一抗（p-STAT3，t-STAT3，1∶2 000稀释；PHB，1∶500稀释），4℃过夜，Washing buffer漂洗后，加入二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG，1∶1 000稀释；碱性磷酸酶标记的兔抗山羊IgG，1∶1 000稀释），室温震荡孵育 2 h，Washing buffer漂洗后BCIP／NBT显色试剂盒显色，扫描条带，采用Image J图像分析软件对蛋白条带进行半定量分析。

2 统计学分析 实验结果数据以¯x±s表示，SPSS13.0统计软件进行统计学处理，各组间比较采用单因素方差分析，差异有显著性时采用LSD（least significant differernce）法进行两两比较。

3 结果

3.1 硫化氢后处理抑制缺氧／复氧诱导的心肌细胞毒性 实验结果显示，缺氧前各组心肌细胞的存活率、培养液中LDH的释放基本一致，差异无统计学意义（P＞0.05）。复氧2 h，NP组可明显的抑制H／R引起的细胞毒性，使细胞存活率明显的升高，LDH的释放明显减少，与H／R组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示硫化氢后处理可以对抗缺氧／复氧诱导的心肌细胞毒性，见Fig 1A、1B。

3．2 硫化氢后处理抑制缺氧／复氧诱导的心肌细胞凋亡 用Annexin V-FITC和PI对心肌细胞进行染色，流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡情况。如Fig 2所示，与对照组（7.76±1.26）%相比，H／R组细胞凋亡率明显的升高（25.37±4.73）%；与H／R组比较，NP组细胞凋亡率明显的降低，为（14.97±2.03）%，说明硫化氢后处理可以抑制H／R诱导的心肌细胞凋亡。

Fig 1 Hydrogen sulfide postconditioning inhibits the cytotoxicity by hypoxia／reoxygenation（%，¯x±s，n＝5）

Fig 2 Hydrogen sulfide postconditioning inhibits the apoptosis by hypoxia／reoxygenation（%，¯x±s，n＝3）

3．3 硫化氢后处理对缺氧／复氧心肌细胞的STAT3通路的激活 实验结果显示，与对照组比较，H／R组p-STAT3表达水平增高（P＜0.05）。加入NaHS使p-STAT3蛋白表达水平进一步升高（P＜0.05），而DMSO组与H／R组比较，差异无统计学意义。当加入JAK2／STAT3信号通路抑制剂AG490后，与NP组相比，发现NaHS同时加入AG490明显抑制了p-STAT3蛋白表达的升高 （P＜0.05），说明硫化氢后处理可以激活STAT3通路，见Fig 3。

Fig 3 Hydrogen sulfide postconditioning induces the STAT3 phosphorylation in cardiomyocytes（¯x±s，n＝3）

3．4 硫化氢后处理上调心肌细胞PHB蛋白的表达Western blot结果显示，应用 10μmol·L－1的NaHS（H2S供体）后处理心肌细胞，可以明显的增加PHB蛋白的表达水平，与对照组和H／R组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），而 NaHS同时加入AG490可以明显抑制升高的PHB蛋白的表达（P＜0.05），上述结果提示硫化氢后处理可以上调PHB蛋白的表达，并且可能与激活的STAT3有关，见Fig 4。

3．5 JAK2／STAT3信号通路介导硫化氢后处理对抗缺氧／复氧引起的心肌细胞损伤 为了明确硫化氢后处理是否通过JAK2／STAT3信号通路对抗缺氧／复氧引起的心肌细胞损伤，应用JAK2／STAT3信号通路的特异性抑制剂AG490，发现与NP组比较，NaHS同时加入AG490使心肌细胞的毒性明显升高，细胞的存活率下降，培养液中LDH的释放增加（P＜0.05，见Fig1A、1B），同时细胞的凋亡率也明显的增加（P＜0.05），见Fig2。提示AG490可以减弱硫化氢后处理的心肌保护作用，说明JAK2／STAT3信号通路参与了硫化氢后处理对抗缺氧／复氧引起的心肌细胞损伤。

Fig 4 Hydrogen sulfide postconditioning upregulates PHB expression in cardiomyocytes（¯x±s，n＝3）

4 讨论

近年来，越来越多的研究证明，H2S是心肌缺血／再灌注损伤的保护剂。本课题组前期的研究也表明，H2S后处理可以减轻离体大鼠心脏缺血／再灌注（I／R）损伤，对心肌具有保护作用［2］，其机制可能与抑制线粒体渗透性转换孔的开放［9］、激活细胞信号通路［3］、调节 Cx43蛋白的表达［10］等有关，但 H2S对心肌缺血／再灌注损伤的具体保护机制仍未阐明。

抗增殖蛋白是一种核基因编码的蛋白质，最初被认为是一种核转录调控因子。近年来的研究发现，该物质对心肌具有保护作用。在心肌缺血缺氧时，机体一般通过上调PHB的表达，发挥心肌保护作用［4－5］。并且过度表达的抗增殖蛋白可以保护由低氧诱导的H9c2心肌细胞的死亡［11］。本实验发现在NP组PHB蛋白的表达水平增加，同时LDH和细胞的凋亡率降低，推断PHB在硫化氢后处理减轻心肌缺氧／复氧损伤中可能发挥重要的作用。

JAK2／STAT3信号通路是近年来新发现的一条重要的细胞内信号传导通路。研究发现［12－13］，该通路在药物预处理及缺血后处理中均起到重要的作用。本课题组前期的实验也得出p-STAT3在硫化氢后处理的心肌保护中发挥重要的作用［3］。另外，也有文献报道p-STAT3可以调节PHB蛋白的表达，其抑制剂AG490可以抑制PHB的表达上调［6］。为了研究PHB在硫化氢后处理心肌中的保护机制，本实验应用JAK2／STAT3通路抑制剂AG490，观察心肌细胞的存活率、LDH的释放、细胞凋亡率以及PHB蛋白的表达情况。

通过本实验，我们发现与H／R组相比，NP组心肌细胞的存活率明显提高，LDH的释放以及细胞凋亡率明显下降，提示硫化氢后处理可以抑制缺氧／复氧诱导的心肌细胞毒性及细胞凋亡。而加入AG490抑制JAK2／STAT3通路后，H2S的上述保护作用被逆转了，使心肌细胞的毒性增加，细胞凋亡率也明显上升了，说明JAK2／STAT3可以介导H2S后处理抑制缺氧／复氧诱导的心肌细胞损伤。同时我们还发现：在正常条件下，心肌细胞中p-STAT3和PHB蛋白的表达均较少；缺氧复氧后，二者表达量均上调，但在H2S后处理后，与H／R组比较，二者的表达水平明显的升高，提示H2S后处理会诱导上述蛋白的表达；而加入AG490后，上述蛋白的表达量均又下降，提示AG490抑制了H2S后处理诱导p-STAT3和PHB蛋白的表达能力，提示JAK2／STAT3信号可能通过诱导PHB蛋白的表达而参与硫化氢后处理的心肌保护作用。与 Jia等［6］发现的 p-STAT3通过上调PHB蛋白的表达发挥保护心肌细胞作用相一致。

综上所述，H2S后处理抑制缺氧／复氧诱导的心肌细胞损伤可能与PHB的表达上调有关，并且可能是通过JAK2／STAT3信号通路的激活而实现的；但硫化氢后处理与PHB之间的具体机制还有待于进一步的研究。

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