单因素实验结合响应面法优化朱砂根总皂苷的提取工艺

吴琴,陈珣

(1.贵州理工学院制药工程学院,贵阳 550003;2.毕节学院化学工程学院,毕节 551700)

单因素实验结合响应面法优化朱砂根总皂苷的提取工艺

吴琴1,陈珣2

(1.贵州理工学院制药工程学院,贵阳 550003;2.毕节学院化学工程学院,毕节 551700)

目的 优化朱砂根的最佳提取工艺,为朱砂根的研究提供基础。方法以朱砂根总皂苷的含量为指标,在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,设计3因素3水平的响应面法实验,优化朱砂根的最佳提取工艺。结果单因素实验结合响应面法优化得到的朱砂根最佳提取工艺为:以70%乙醇为溶剂,提取温度70℃,料液比为1∶16,提取时间为3 h,在此条件下,总皂苷百分含量的理论预测值为2.29%。结论通过响应面法优化得到的朱砂根总皂苷提取工艺稳定、可靠,具有一定的实用价值。

朱砂根;总皂苷;响应面法;提取工艺

朱砂根为紫金牛科紫金牛属植物,是《中华人民共和国药典》1977年版收载的紫金牛属两种药用植物之一[1],主要分布于我国浙江、湖南、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广东和广西等省区。药效学研究表明,朱砂根总皂苷具有明显抑制癌细胞增殖、调节免疫力、抗炎抑菌、抗病毒等作用,朱砂根所含三萜皂苷有兴奋子宫、抗早孕的作用[2-5]。响应面法已广泛用于中药有效成分的提取工艺研究[6-8]。为了系统详尽地研究黔产朱砂根总皂苷的提取工艺,笔者在单因素实验的基础上,通过响应面法对其提取条件进行优化,为其进一步开发和利用提供有价值的工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海秼马恒温设备厂);DF-4电磁式矿石粉碎机(杭州卓驰有限公司);AUY220电子分析天平(日本岛津公司); SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); HH-4恒温水浴锅(金坛市宏华仪器厂);SHT型搅拌数显恒温电热套(菏泽市牡丹区大华仪器有限公司);Cary 50紫外-可见分光光度计(美国瓦里安中国有限公司)。

1.2 试药 实验所用朱砂根购于贵阳;标准品人参皂苷RG1购于上海金穗生物科技有限公司;无水乙醇、石油醚、甲醇、冰醋酸、高氯酸、香兰素均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 朱砂根总皂苷含量的测定方法

2.1.1 人参皂苷标准曲线的绘制 准确称取人参皂苷RG1标准品1.7 mg,甲醇溶解定容至10 mL,配制成0.17 mg·mL-1标准溶液。分别取上述人参皂苷RG1标准液0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL于10 mL量瓶中,然后加入5%香兰素-冰醋酸溶液0.1 mL,高氯酸0.25 mL,摇匀后置于60℃恒温水浴锅加热反应40 min,冷却5 min后加入冰乙酸1 mL,摇匀,80%甲醇定容,摇匀,静置15 min[9]。以80%甲醇溶剂作空白参比进行全波长扫描,供试品溶液在540 nm处有最大吸收。故选择540 nm为测定波长,测定各标准溶液的吸光度(A),然后以人参皂苷浓度(C)为横坐标,A为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程A= 11.740C-0.147(r=0.999 7)。

2.1.2 样品含量测定 准确称取处理过的朱砂根样品于50 mL圆底烧瓶中,加入70%乙醇后加热提取,抽滤定容至50 mL摇匀,得供试品溶液。将供试品溶液减压浓缩至原来体积的1/3后用石油醚萃取,脱去脂溶性成分,收集含朱砂根粗皂苷的浸提浓缩液。准确移取0.2 mL浓缩液于10 mL量瓶中,其余步骤与标准曲线的制作方法相同,测其吸光度。根据回归方程计算出皂苷的浓度,进而可以得到朱砂根中总皂苷的百分含量。

式中,W为样品质量,C为皂苷溶液浓度,Y为朱砂根总皂苷的百分含量,50为所取测定溶液的倍数。

2.2 单因素考察

2.2.1 料液比的考察 按照“2.1.2”项的实验步骤,其他条件不变,料液比分别考察了1∶8,1∶12,1∶16,1∶20及1∶24。实验结果显示,总皂苷百分含量随着料液比的增大而增加,当料液比为1∶16时,总皂苷得率较大,而再增加溶剂体积总皂苷的含量有所降低,因此选择1∶16为提取总皂苷的最佳料液比。

2.2.2 提取时间的考察 按照“2.1.2”项的实验步骤,其他条件不变,提取时间分别考察了2.0,2.5, 3.0,3.5,4.0 h。结果显示,总皂苷得率一开始随着提取时间的增大而增加,而当提取时间为3.5 h后有所下降,因此提取时间选3 h。

2.2.3 提取温度的考察 按照“2.1.2”项的实验步骤,其他条件不变,提取温度分别考察了60,65,70, 75,80℃。结果显示,总皂苷得率随着温度的上升而增大。当温度为70℃时,总皂苷得率最大,继续升高温度,总皂苷得率没有明显提高,因此提取温度控制在70℃。

2.3 响应面法确定朱砂根总皂苷提取最佳工艺条件

2.3.1 响应面实验方案及结果 在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理对提取条件进行优化,设计3因素3水平的响应分析实验,选择料液比、提取时间、提取温度3个因素,分别以X1、X2、X3表示,每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1,0,1进行编码,以皂苷得率(Y)为响应值,各因素编码值见表1,实验方案及实验结果见表2。

2.3.2 拟合回归方程的建立 对实验数据进行多项式拟合回归,以得率(Y)为因变量,料液比(X1)、浸提时间(X2)、提取温度(X3)为自变量,建立回归方程如下:

回归方程的方差分析结果见表3。从表3可知回归显著,一次项、二次项和交互项都是显著的,且方程的失拟项很小,表明该方程对实验拟合情况好,实验误差小。因此,可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析,各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

表1 响应面分析因子和水平表Tab.1 Factorsandlevelsofresponsesurface experiments

表2 响应面实验方案及结果Tab.2 Projectsandresultsofresponsesurface experiment

2.3.3 响应面图解析 根据回归方程绘制出响应面曲图,通过响应曲面图可分析当料液比、浸提时间、提取温度其中一个因素固定时,另外两个因素对朱砂根总皂苷含量影响,结果见图1。从图1A可以得知,在料液比的量较低时,随时间的增加总皂苷的百分含量逐渐增多,当料液比的量发生变化时,总皂苷百分含量逐渐增加,但不显著。从图1B得知,料液比和提取温度对总皂苷的影响也是如此。图1C可以看出,浸提时间对总皂苷得率的影响没有提取温度的显著,但其等高线为椭圆,说明浸提时间和提取温度交互作用显著。

表3 回归方程的方差分析结果Tab.3 Variance analysis on regression equation

3 讨论

本实验以朱砂根总皂苷含量为指标,通过Design-Expert 8.05软件分析,得到总皂苷的最佳提取条件为:采用70%的乙醇为溶剂,提取温度70℃,料液比为1∶16,提取时间为3 h。在此条件下,总皂苷百分含量的理论预测值为2.29%。为了验证模型方程的适用性和可靠性,采用上述工艺条件进行总皂苷提取实验,在此条件下进行了3次平行实验,总皂苷平均含量为2.28%(理论预测值为2.29%)。方差分析结果表明二者差异无统计学差异(P＞0.05),与预测值基本相符,说明此方程与实际情况拟合很好,充分验证了模型的合理性。

本研究通过单因素实验分别考察了提取温度、料液比、提取时间对朱砂根总皂苷含量的影响,并应用响应面法对朱砂根总皂苷的提取条件进行了优化,结果表明提取时间、料液比、提取温度对朱砂根中总皂苷得率的影响不是单一的线性关系。回归分析和验证实验表明了该响应面法的合理性和可行性,有一定的使用价值。响应面法优化提取朱砂根总皂苷,不仅节省了大量的时间和溶剂,而且操作简单,提取的药液杂质少,有效成分易于分离、纯化,提取温度低,还能有效地保护活性物质的成分,提高了经济效益,为今后有效利用朱砂根资源提供了一种实用、经济的方法。

图1 料液比与浸提时间(A)、料液比与提取温度(B)和提取时间与浸提温度(C)交互影响总皂苷得率曲面图Fig.1 Kyrtograph on interaction affect of solid-liquid ratio and extraction time(A)、solid-liquid ratio and extraction temperature(B)and extraction time and extraction temperature(C)on total saponins yeild

[1] 梁克明,王四旺,王晓娟.九节龙皂苷对8株人癌细胞的抑制作用[J].第四军医大学学报,2001,22(7):671-672.

[2] 关雄泰,汪茂田,宫予敏,等.朱砂根中皂苷元及次生苷的研究[J].中草药,1987,18(8):2-4.

[3] 宿树兰,李永辉,欧阳臻,等.紫金牛属药用植物中三萜皂苷成分的研究进展[J].中药材,2003,26(2):144-148.

[4] 海文利,汤海峰,马宁,等.紫金牛属植物中皂苷的研究进展[J].天然产物研究与开发,2012,24(10):1474-1479.

[5] 张伟,李锟,李东,等.朱砂根化学成分和药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(11):279-282.

[6] 李璐,吴文锦,黄凤洪,等.响应面法优化微波提取竹节参总皂苷的工艺条件[J].食品科技,2010,35(6):222-226.

[7] 刘剑青,肖小年,许英伟,等.响应面法优化藠头中皂苷的提取工艺研究[J].食品工业科技,2013,34(1):253-256.

[8] 吴祥庭,朱涛,郑巧敏,等.响应面法优化山药皮中皂苷提取的研究[J].中国粮油学报,2011,26(6):91-96.

[9] 李文仕.分光光度法测定三七伤药胶囊中三七总皂苷的含量[J].黑龙江医药杂志,2010,23(1):5-7.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.028

Optimization of Extraction Technology for Total Saponins of Ardisia Crenata by Singlefactor Experiment Combined with Response Surface Methodology

WU Qin1,CHEN Xun2
(1.School of Pharmaceutical Engineering,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550003,China;2.School of Chemical Engineering,Bijie University,Bijie 551700,China)

Objective To optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of total saponins and to provide a basis for theArdisia crenatastudy.MethodsBased on the results of the single-factor tests and the Box-Behnken central composite experimental design principles,a response surface methodology which has three factors and three levels was designed to optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of saponins.ResultsA maximal extraction yield of total saponins reached 2.29%under the optimal conditions as follows:70%alcohol was used as extraction solvent with the material to liquid ratio of 1∶16,the extraction time was 3 h at 70℃.ConclusionThe optimized extraction process is accurate,reliable and practically valuable.

Ardisia crenata;Total saponins;Response surface methodology;Optimization of extraction

R282.71;TQ460.6

A

1004-0781(2014)08-1080-03

2013-09-24

2013-12-02

吴琴(1974-),女,贵州贵阳人,副教授,博士,主要从事新农药设计与合成。电话:(0)18212819544,E-mail: wuqin1974@163.com。