抗生素在植物组织培养中抑制污染应用研究

陈云风，吴玉婷

(宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 36000)

植物组织培养技术是一门实用性非常强的现代生物技术，被广泛地应用于各个领域，在科研与生产上都具有广泛的应用价值。［1］微生物所引起的植物组培污染一直是当前制约植物组培发展的主要障碍，在组织培养过程中，其污染源主要是真菌(木霉、青霉、曲霉、毛霉)、细菌 (金黄色葡萄球菌)和其它未被检查出的细菌。［2］近年来，抗生素在植物组织培养污染防止中应用较为广泛，多菌灵和青霉素均属于抗生素一类。已有实验表明，多菌灵和青霉素在组培中对污染有一定的抑制作用，合理利用可以利减少培养过程中的污染率，提高成活率，［2－6］抗生素在植物组织培养中抑制污染的研究，为植物组培中抗污染研究提供一条全新的思路与途径，具有较高的理论与应用价值。

为进一步研究抗生素在植物组织培养中对污染的抑制效果，综合前人的实践经验和研究结果，本文以月季为培养材料，通过在培养基中添加不同浓度的多菌灵和青霉素，探索植物组织培养中抗生素对细菌、真菌及培养效果的影响，为今后相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

月季茎段，取生长旺盛的嫩枝;pH计 (型号PH－107PH－107APH－108);青霉素 (佳泰 注射用青霉素钾0.5g(80万单位));多菌灵 (绿阳园艺国光50%多菌灵100克)。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

MS培养基 (pH=5.8)。在配制培养基过程中，加入植物生长调节剂和蔗糖后，将各组培养基中分别单独加入不同浓度的青霉素和多菌灵，青霉素20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L和多菌灵50mg/L、60mg/L、80mg/L;此外还混合两种抗生素加入培养基中，每组多菌灵和青霉素的浓度分别为50mg/L:20mg/L、60mg/L:20mg/L、80mg/L:20mg/L、 50mg/L:40mg/L、 60mg/L:40mg/L、80mg/L:40mg/L;各处理都以不添加任何抗生素为对照，然后用pH计调节溶液pH至5.8后，趁热分装于100ml三角烧瓶中，每个三角烧瓶15－20ml培养基，分为14组，每组40瓶，贴上标签，在高压灭菌锅中121℃下灭菌20min，冷却待用。

1.2.2 接种与培养

取生长旺盛的月季嫩枝，选合适茎段，流水冲洗，用软刷轻轻刷洗干净，放入75%的酒精中漂洗2次，每次持续30s，再用无菌水中清洗3次，然后放入6%的次氯酸钠溶液中浸泡10min，取出后在无菌水中清洗3次，将灭菌好的材料接种在添加不同种类与浓度的抗生素培养基中，将其放入恒温培养箱中 (培养温度控制在18－22℃，每日用日光灯光照12h)进行培养。

1.2.3 结果观察及数据处理

接种10d后观察月季生长状况，连续观察10d，记录各个不同处理的染菌与枯死的情况，统计观察结果。细菌、真菌感染及枯死观察方法如下:月季细菌感染现象为，组织周围的菌落一般呈现较湿润、较光滑、较透明、较粘稠、质地均匀、小而突起或大而平坦、菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致、一般有臭味或酸败味等;月季真菌感染现象为:组织周围菌落常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有的表面还能呈现红、褐、绿、黑、黄等不同孢子的颜色;月季组培枯死现象为月季没有微生物感染现象，仅仅为组织发黑、枯死，没有成活现象。

试验于2012年5—7月在宜春学院作物遗传育种实验室进行。数据处理采用Excel软件。

2 结果与分析

2.1 添加不同浓度多菌灵对细菌和真菌的影响

在培养基中添加一定浓度的多菌灵能明显减少组培真菌感染，对细菌抑制作用不明显。从表1可知，多菌灵有一定的抑制或杀灭真菌的效果，当培养基中多菌灵的浓度达到60mg/L或80mg/L的时候，真菌感染率从40%下降至0%;同时实验表明，细菌感染率没有出现明显降低作用，在培养基中加入一定浓度多菌灵对细菌没有明显抑制或杀灭作用。

表1 不同浓度多菌灵对月季组培苗成活率的影响 (%)

在本试验多菌灵添加范围内可以看出，加入多菌灵可以提高组培苗至少12.5个百分点的成活率。多菌灵对组培苗是既有抑菌作用，同时对组培苗有一定的伤害，枯死率随多菌灵浓度增大有增加的趋势，从而也在一定程度限制多菌灵的使用浓度，本试验培养基中添加多菌灵最适浓度为60mg/L，成活率达47.5%。

2.2 添加不同浓度青霉素对细菌和真菌的影响

在培养基中添加一定浓度的青霉素能明显减少组培细菌感染。从表2可知，青霉素有一定的杀灭细菌的效果，且当浓度达到30mg/L的时候，细菌的感染率为0%;在培养基中添加一定浓度的青霉素对真菌感染率没有很大变化，说明青霉素对真菌没有明显抑制或杀灭作用。

就枯死率而言，培养基中未添加青霉素时枯死率为15%，当一定浓度青霉素加入后，枯死率都提高了5个百分点以上，说明青霉素对培养物也是具有一定损伤，且青霉素使用浓度与枯死率呈正相关关系。

在本试验多菌灵添加范围内可以看出，加入青霉素可以提高组培苗至少7.5个百分点的成活率。且当青霉素浓度为40mg/L的时候，月季组培苗成活率最高。青霉素对组培苗也是有抑菌作用，同时也会损伤组培苗的，添加更高浓度的青霉素肯定对组培苗伤害更大，所以青霉素浓度也要适宜。本试验培养基中添加青霉素最适浓度为40mg/L，成活率达40.0%。

表2 不同浓度青霉素对月季组培苗成活率的影响 (%)

2.3 添加不同浓度的多菌灵和青霉素对培养组织的影响

在培养基中同时加入一定浓度多菌灵和青霉素混合溶液，可以有效抑制真菌和细菌感染，均大大提高月季组培苗的成活率。从表3可知，多菌灵和青霉素加入到培养基后，组培苗的成活率由25.0%提高至50.0%以上，成活率提高一倍以上。就真菌和细菌感染率而言，两种抗生素同时加入培养基中，真菌和细菌感染率大大降低，感染率能为0。但是，组培苗的枯死率也有一定提高，由15.0%提高至35%以上。

且当多菌灵浓度60mg/L、青霉素浓度40mg/L时候，细菌和真菌的感染率也均为0.0%。月季苗成活率最高，达60%。

表3 不同浓度的多菌灵和青霉素对月季组培苗成活率的影响 (%)

3 讨论

研究表明，在培养基中分别加入多菌灵和青霉素，对月季组培污染中的真菌和细菌有一定抑制和杀灭作用，添加适量的抗生素能使培养物污染率降低，能够明显提高植物组培中外植体的成活率。李颖，李春燕［4－5］试验中将已污染的组培苗茎段浸泡在多菌灵和青霉素混合液中，也能抑制污染，表明多菌灵和青霉素能够减少组培污染率，提高外植体成活率。

抗生素是生物新陈代谢的产物，一般是通过阻断微生物的正常代谢途径致死。此外还有研究表明利福平、链霉素、四环素等抗生素类物质，同样可以对微生物有抑制作用，这些抗生素被广泛的应用于各种微生物灭菌，且取得了一定的成效。［7－8］但也有研究表明，抗生素在较高浓度下会对植物的生产产生不利的影响，过高浓度的抗生素同样会杀死植物，［9］这一点在本研究中也得以证实。

组培污染是制约植物组织培养技术发展的主要障碍，探索合适的组培污染防治方法对于组培技术的发展有着极其重要的意义。抗生素在植物组织培养中抑制污染的效果显著，抑制组培污染，提高组培苗的成活率，关键是探索如何选择合适的抗生素种类、使用浓度及处理方法。此外，抗生素等的使用对组织本身的药物残留问题，比如食用的材料进行组培抗生素的添加，其是否残留抗生素，或者对人体是否具有伤害，都需要慎重考虑。

［1］齐春华.植物组织培养技术发展现状及方向［J］.农业科技与装备，2011，(4):10 －11

［2］马翠萍，孙仲序，赵春芝，等.植物组培污染防治的研究概况［J］.生物技术，2002，12(4):46－48

［3］王黎波，李晓燕.抗生素在植物组织培养中控制污染的应用［J］.辽宁农业科学，2007，(3):69－70

［4］李颖，李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用［J］. 林业科技，2002，3(1):6－8

［5］李春燕，李颖.组织培养中青霉素对细菌污染的抑制作用［J］.东北林业大学学报，2000，28(5):97－98

［6］张佐双，朱秀珍.中国月季［M］.北京:中国林业出版社，2006:63

［7］闫海霞，邓俭英，李立志，等.月季组织培养研究进展［J］. 广东农业科技，2012，39(12):53 －56

［8］朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌［J］.植物生理学通讯，1996，32(6):444 －449

［9］田永亮，张文，张国珍，等.两种抗生素对葡萄组培中污染菌的抑制作用［J］.北方园艺，2005，(5):84－85