CPG－ODN对哮喘小鼠KL－6表达的影响

黄维琳，孙 亭，唐晓伟，黄九龙，汪浩然，裴文俊

(1.安徽中医药高等专科学校;2.芜湖市第一人民医院，安徽 芜湖 241000)

气道炎细胞浸润是支气管哮喘的主要特征，免疫反应在哮喘的发病机制中占有重要地位。CpGODN是指一段寡核苷酸序列，其中含有未甲基化的CpG二核苷酸，具有强烈的免疫刺激作用，类似细菌DNA。许多资料证明，CpG－ODN对哮喘动物模型具有预防和治疗作用。KL－6(Krebs Von den Lungen－6)是一种勃液素样的大分子糖蛋白，研究显示血清KL－6可反映肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤、再生程度，可能成为支气管哮喘的早期诊断的指标［1］。本研究以哮喘小鼠为研究对象，观察CpG－ODN刺激对哮喘小鼠后KL－6的表达，探讨CpG－ODN是否能降低支气管哮喘小鼠气道的KL－6表达，从而减轻喘小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤，探讨其可能的发生机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 卵白蛋白、氢氧化铝购自合肥智阳生物科技有限责任公司。全链硫代修饰的人工合成的CpG－ODN，序列为5/－TCCATGACGTTCCTGATGCT－3/，购自Takara公司，KL－6 ELISA试剂盒购自Binding Site公司。

1.2 小鼠哮喘模型的建立 以卵蛋白 (OVA)作为抗原进行致敏和激发，建立小鼠哮喘模型。将小鼠适应性饲养1周后，第1、4、7天分别将含0.01%卵蛋白 (OVA)和2%氢氧化铝各0.1ml注射腹腔，重复一周后第14天将小鼠逐个放入自制的密闭容器中，体积约4L，喷入1%OVA20ml进行雾化激发再次致敏30分钟，连续一周，当小鼠出现明显喷嚏、鼻部潮湿、烦躁、激惹等呼吸道症状为造模成功。

1.3 实验动物分组及处理 清洁级ICR小鼠50只，体重30±2g，雌雄各半，购自南京青龙山实验动物中心。小鼠随机分为哮喘模型组、CpGODN高、低剂量组、地塞米松治疗组、空白对照组，每组10只小鼠。空白对照组以生理盐水致敏和引喘。连续诱喘成功后，哮喘模型组、空白对照组予腹腔注射生理盐水，CpG－ODN高、低剂量组分别予腹腔注射 CpG－ODN10μg/kg/d和1μg/kg/d，地塞米松治疗组予腹腔注射地塞米松1.5mg/kg/d，连续8天。

1.4 病理组织学观察 各组药物处理结束后处死小鼠，取下肺组织浸泡于10%甲醛固定溶液中48小时。常规石蜡包埋，切取肺组织块5μm厚切片;再将切片进行常规二甲苯脱蜡、乙醇脱水、HE染色，在光镜下观察肺组织病理变化并摄片。

1.5 ELISA法测KL－6 各组小鼠于给药后1小时，眼眶动脉取血4－5ml。血液放入在4℃离心机，以4000r/min离心30分钟，留置血清于低温冰箱中备用。各组按试剂盒说明书用ELISA法检测血清KL－6水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行分析。组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠激发后行为性变化 哮喘模型组小鼠出现明显烦躁不安，呼吸急促，鼻部发红、喷嚏、腹肌抽搐，抓鼻，激惹等呼吸道症状。地塞米松治疗组表现较轻，偶有抓鼻，呼吸急促;CpGODN高、低剂量组表现同地塞米松组，空白对照组无明显异常。

2.2 肺组织HE染色结果 哮喘模型组小鼠肺组织镜下肺泡结构紊乱，尤其可见大量炎症细胞浸润，肺泡腔变形不整。CpG－ODN高剂量组光镜下肺组织炎细胞浸润水平明显降低，肺泡结构排列整齐。CpG－ODN低剂量组肺组织炎症较哮喘组轻，肺泡结构轻微紊乱，但仍可见炎症细胞浸润。地塞米松组肺组织炎性浸润较少，肺泡组织结构完整。空白对照组肺组织无明显炎性反应，气道粘膜、肺泡大小正常。

图1 小鼠肺组织光镜下形态学观察 (HE×200)

2.3 各组KL－6表达的结果

采用ELISA法检测发现，与哮喘模型组相比，CpG－ODN高、低剂量组和地塞米松治疗组KL－6的表达明显降低，差异有统计学意义 (P＜0.05);CpG－ODN高剂量组KL－6的表达低于空白对照组 (P＜0.05)，而CpG－ODN组高、低剂量组和地塞米松组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)，(表1)。

表1 ELISA法检测KL－6在各组中的表达(n=10，)

表1 ELISA法检测KL－6在各组中的表达(n=10，)

与哮喘模型组比较:*P＜0.05;与空白对照组比较:#P＜0.05。

3 讨论

现已证实，哮喘存在多种炎细胞的募集，肺泡Ⅱ型上皮细胞的结构和功能也发生改变，尤其是其表面活性物质合成和分泌的的数量、活性以及组成成分［2］。在哮喘的慢性炎症中，小气道及肺组织病变显著，许多来源于肺泡Ⅱ型上皮细胞的黏附分子、细胞因子和炎症介质也参与其中。越来越多的学者关注到哮喘呼吸道、细胞结构损伤与修复等功能的变化。

日本学者研究肺腺癌时发现了一种糖蛋白，即KL－6，相对分子质量接近200000［2］。正常的肺泡Ⅱ型上皮细胞和人肺纤维组织是肺泡腔内KL－6的主要来源，可用渗出机制解释肺泡内出现的KL－6。即当存在肺泡损伤，导致肺泡Ⅱ型上皮细胞再生，或者气一血交换屏障的通透性增加，使血清KL－6浓度升高。

哮喘时肺泡Ⅱ型上皮细胞形态、结构发生改变，其增殖、受激发或受损后可以大量分泌KL－6。故可认为KL－6能特异性作为判断肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的血清学指标，研究表明它既与哮喘呼吸道炎症程度有关，又与Th2优势有关［3］。研究还表明KL－6对人的纤维母细胞具有趋化作用，可能通过诱导纤维母细胞在受损肺泡腔的移行和积聚促使肺泡纤维变性［4］。还可以加强血小板源性生长因子、内皮素－1等促纤维原细胞增殖作用［5］。因此通过检测血清中KL－6水平表达，可以判断哮喘患者肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤和哮喘病情的严重程度。

早在1995年CpG－ODN序列就被发现具有较强的免疫刺激活性，故称其为免疫刺激序列。其中CpG的二核苷酸基序被认为是其主要免疫刺激基序［6］。CpG－ODN通过识别细胞TLR－9受体激活免疫细胞，从而强烈地诱导Thl型免疫应答，抑制与变态反应有关的Th2型免疫应答，可以从根本上减轻哮喘和变态反应性疾病过程［7］。研究还发现CpG－ODN可通过降低IL－4及IL－5水平，显著增加IFN－γ的生成，使肺部炎症大大减轻，对肺组织GATA－3 mRNA的表达同时进行抑制［8］。

流行病学调查表明，儿童时期反复呼吸道细菌感染可降低哮喘的患病率，可能因为细菌DNA中含有的CpG结构，其调节诱导机体建立Th1型免疫反应，抑制Th2型反应，从而逆转哮喘的免疫学改变［9］。

本实验结果显示，无论是CpG－ODN还是地塞米松干预，均有降低气道炎症作用，作用哮喘小鼠后均能降低哮喘小鼠血清中KL－6水平，说明在抑制哮喘所致的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中两者具有相似的保护作用。并且随着剂量增大CpG－ODN作用越明显，说明在一定剂量范围内CpG－ODN作用可以呈剂量累加效应。在当今雾霾等环境所致哮喘呈高发的趋势下，如何选择更好的方法降低哮喘显得迫在眉睫。CpG－ODN成为哮喘治疗的新一代免疫调节剂，其发展潜力巨大。本实验中发现高剂量的CpG－ODN与正常空白对照组比较，KL－6水平差异有显著性，CpG－ODN是否存在剂量双重效应也未可知，尚待进一步动物及临床实验加以证实，从而为临床应用提供实验指导。

［1］Ohnishi H，Yokoyama A，Kondo K，et al.Comparative study of KL－6，surfactant protein－A，surfactant protein－D，and monocyte chemoattractant protein－1 as serummarkers for interstitial lung diseases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165(3):378 －381

［2］陈红梅，张建华，徐仑，等.KL－6在哮喘小鼠血清和肺泡灌洗液中的表达［J］.临床儿科杂志，2008，26(1):27－29

［3］张建华，郁志伟，陈红梅，等.布地奈德、卡介苗干预对支气管哮喘小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响［J］.实用儿科临床杂志，2011，26(16):1250－1255

［4］庞红梅，崔刘福.血清KL－6与风湿病肺间质病变［J］.临床荟萃，2009，24(5):455－457

［5］Filbrun AG，Lumeng CN，Nasr SZ，et al.Infant pulmonary function testing guides therapy in cystic fibrosis lung disesas［J］.Res Med CME，2011，(4):17－19

［6］黄维琳，王炯，刘荣玉，等.CPG－ODN对鼠巨噬细胞TLR－9及Th1/Th2类细胞因子分泌的影响 ［J］.安徽医科大学学报，2008，43(1):28－31

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［9］金美玲，蔡映云，袁正宏，等.CpG DNA预防小鼠哮喘模型的形成 ［J］.复旦学报 (医学版)，2002，29(5):376－378