睡眠剥夺对大鼠颞下颌关节髁突组织p38信号通路相关蛋白表达的影响

马 川，陈虹瑜，曲竹丽，赵华强

(1山东大学口腔医学院，济南250012;2山东省口腔生物医学重点实验室;3济南市口腔医院;4山东医学高等专科学校)

颞下颌关节紊乱病(TMD)是咀嚼肌疼痛和颞下颌关节(TMJ)破坏的疾病总称，是口腔科的常见疾病［1］。研究发现，睡眠剥夺在TMJ破坏中起重要作用［2］。p38信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要组成部分，p38上游的MKK6蛋白是活化p38的激酶［3］。研究发现p38信号通路在膝、踝等大关节破坏过程中起重要作用［4］;但其在TMJ关节破坏中的作用鲜见报道。2012年11月～2013年10月，我们观察了睡眠剥夺大鼠TMJ关节髁突组织中p38和MKK6的表达，探讨p38通路在睡眠剥夺引起TMD破坏中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:40只Wistar大鼠，雄性，体质量(130±10)g，一级，由山东大学实验动物中心提供;均饲养于恒温房间;随机分为睡眠剥夺组(SD组)及对照组，每组各20只。试剂与仪器:磷酸化-p38(P-p38)兔抗大鼠多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司);磷酸化-MKK6(P-MKK6)兔抗大鼠多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司);免疫组化SP染色试剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司);多平台睡眠剥夺模型(济南军区总医院动物中心制作);旷场试验箱(济南军区总医院动物中心制作);石蜡切片机(THERMO，美国);光学显微镜(BX51，日本OLYMPUS公司);激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP5，德国 LEICA公司);Image Pro-plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybemetics公司)。

1.2 睡眠剥夺模型制作及效果评估

1.2.1 模型制作 制作实验用水槽2个，长、宽、高分别为110 cm×70 cm×40 cm，水槽内注满水。SD组所用水槽内有15个直径6.3 cm的小平台(水槽1)，高于水面约1.0 cm;对照组所用水槽内有一直径为16 cm的大平台(水槽2)。SD组参照改良多平台法［5］建立睡眠剥夺模型:实验室温度控制在25℃左右，每天日光灯照射12 h后黑暗12 h;将大鼠放于水槽1的小平台上，当其进入异相睡眠时期时由于全身肌肉张力降低导致面部触水而惊醒，从而造成睡眠剥夺，共持续4 d。对照组放于水槽2的大平台，可自由运动、睡眠;其他条件与SD组相同。

1.2.2 效果评估 制作长、宽、高分别为100 cm×100 cm×50 cm的木箱，其内壁涂黑，箱底划分成4 cm×4 cm的25个方格。采用矿场试验评价睡眠剥夺效果:将两组大鼠放入木箱中，计算其5 min内水平活动和垂直活动得分。水平活动得分:大鼠斜跨1格或沿直线走两格记为1分。垂直活动得分指直立次数，以动物双足离开地面直至放下为1分。根据大鼠的一般状况及水平活动、垂直活动得分判断模型制作情况。结果显示，对照组大鼠均性情温和、毛色顺滑、正常活动。SD组大鼠有尖叫、狂躁不安、打架、竖毛等睡眠剥夺应激表现。SD组及对照组水平活动得分分别为(175.53 ±35.43)、(106.19 ±30.32)分，垂直活动得分分别为(32.43 ±5.13)、(12.45 ±5.38)分，P 均 ＜0.05。表明 SD 组睡眠剥夺模型成功建立。

1.2.3 观察项目

1.2.3.1 TMJ病理变化 对照组、SD组分别于造模4 d后取材。1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉后颈椎脱臼法处死，采用锐性分离与钝性分离相结合，仔细分离颞下颌关节，上端从颞下颌关节上腔紧贴关节盘剪断，下端从髁突颈部剪断，完整取出颞下颌关节关节盘、髁状突。生理盐水冲洗，4%多聚甲醛液固定24 h。于1 mmol/L甲酸钠和8 mmol/L甲酸等量混合的脱钙液中脱钙1周，流水冲24 h。常规脱水、透明、浸蜡包埋。4 μm厚石蜡切片，行HE染色。显微镜下(100×)观察关节髁突病理变化。

1.2.3.2 p38、MKK6蛋白表达 采用 SP免疫组织化学染色，取TMJ石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶，滴加封闭用正常山羊血清工作液;分别滴加 P-p38、P-MKK6一抗 50 μL，4 ℃湿盒过夜;阴性对照采用PBS代替一抗;加入山羊抗兔二抗，室温孵育15 min;辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min;DAB显色;苏木精复染，脱水，透明;封片，显微镜(400×)下观察。MKK6阳性蛋白主要表达于细胞质，p38阳性蛋白主要表达于细胞核，少量在胞质。以背景清晰、细胞质中出现棕黄色或黄色颗粒为MKK6阳性表达，细胞核中出现棕黄色或黄色颗粒为p38阳性表达。每张切片取5个视野，分别计数细胞总数及其阳性细胞数，计算阳性细胞率，取其平均值。阳性细胞率 ＜10%为 －;10% ～50%为+;＞50%为++;10% ～100%为阳性［6］。每个标本取连续5张免疫组化片，对颞下颌关节髁突的同一位置，采用数码显微照相系统拍照，Imagepro-Plus 6.0专业图像分析软件计数MKK6、p38的平均光密度值(MOD值)。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件，计量资料以±s表示，采用方差分析、t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMJ病理变化 对照组TMJ髁突表面光滑，自表层向深层可分为四个带:关节表面带、增殖带、纤维软骨带、钙化软骨带。细胞排列规则，胶原纤维致密而规则。髁突、关节盘组织形态较好，关节腔隙正常。SD组大鼠TMJ关节髁突表面胶原纤维水肿、松解，排列紊乱，髁突组织学纤维软骨结构变薄，关节骨质内部分可见到骨细胞消失、骨陷窝空虚。见图1。

图1 两组TMJ病理表现(×100，HE染色)

2.2 MKK8、p38蛋白表达 SD组、对照组 MKK6阳性细胞率分别为48.3%、0.2%;SD组p38阳性细胞率分别为49.2%、0.2%，P 均 ＜0.05。SD 组、对照组MKK6蛋白表达(MOD值)分别为0.254±0.008、0.108 ±0.061;p38 蛋白表达分别为 0.273 ±0.031、0.119 ± 0.071 ，均高于对照组(P 均 ＜0.05)。

3 讨论

研究发现，睡眠障碍与TMD的发病存在一定联系［7］。睡眠剥夺可以引起生物内平衡失调以及生物节律紊乱，长期的睡眠剥夺还会降低免疫功能，使机体处于慢性应激状态［8］。本研究成功建立了大鼠睡眠剥夺模型，通过对TMJ的病理观察，发现睡眠剥夺大鼠TMJ髁突表面软骨结构出现病理性损伤，这种病理性损伤的出现已被证实与TMJ关节破坏的发生密切相关［9］。

p38通路激活后广泛参与细胞凋亡、炎性因子的产生、细胞因子的转录调节等［10］。本研究结果显示，与对照组相比，SD组TMJ关节软骨中p38通路的上游激酶MKK6及p38的表达明显增加，证实p38信号传导通路被激活。其分子机制可能是睡眠剥夺状态下大鼠咀嚼行为明显增多和咬肌活动增加;TMJ因承受更多的运动负荷出现TMJ滑膜炎以及导致 IL-1、TNF-α 等炎性因子活性升高［9，11］。而这些炎性因子已被证实可激活p38信号通路［12］。p38信号通路激活后可在TMJ软骨中促进基质金属蛋白酶的合成及基质破坏，引起关节软骨的病理性改变，对 TMJ髁突软骨产生破坏，继而引发 TMD［13］。

综上所述，睡眠剥夺可激活下颌髁突表面软骨内的p38信号通路，这一通路的激活与睡眠剥夺导致的髁突软骨组织破坏密切相关。

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