乳腺癌组织HER-2扩增状态及其与组织微血管生成拟态的相关性

沈溪明，郭友逢，何欣欣，孙 倩，陈耿标，叶 明，曾韵洁

(中山大学附属第二医院，广州510120)

血管生成拟态(VM)是肿瘤细胞形成的可以运送血液和营养物质的管道样结构，是肿瘤组织内除血管外的另一种血液供应方式。研究发现，VM与肿瘤的进展及患者预后存在密切关系［1］。人类表皮生长因子受体2(HER-2)是判断乳腺癌患者预后的重要因子［2，3］。但HER-2蛋白表达及基因扩增与乳腺癌患者VM的相关性尚不清楚。2012年10月～2013年6月，我们观察了乳腺癌组织中HER-2蛋白表达和基因扩增状态及VM表现，探讨三者之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取中山大学附属第二医院病理科存档的乳腺癌石蜡标本200例，均为女性，年龄42～85(50.24 ±9.57)岁，肿瘤直径(3.54 ±0.21)cm。病理类型:乳腺浸润性导管癌176例，乳腺小叶癌18例，乳腺髓样癌4例，其他2例。所有患者术前均未接受化疗或基因治疗。

1.2 观察项目

1.2.1 VM病理改变 采用CD34和PAS双重染色法。常规石蜡切片，脱水后EDTA抗原修复，根据免疫组化Envision二步法常规行 CD34染色，DAB显色，镜下观察内皮细胞着色后终止显色，行PAS复染，蒸馏水冲洗，苏木精染核，封片。VM通道内无内皮细胞衬覆，通道外基底膜PAS染色为阳性。

1.2.2 HER-2蛋白表达 采用免疫组化法。常规石蜡切片，二甲苯脱蜡后梯度酒精脱水，EDTA抗原修复后PBS冲洗，滴加HER-2抗体孵育1 h，PBS冲洗，滴加广谱二抗，常温下孵育30 min，DAB显色，苏木素复染。HER-2蛋白阳性为细胞膜呈棕褐色。细胞膜完整或不完整着色或阳性细胞数＞10%为阳性。细胞膜未着色或阳性细胞数＜10%为阴性。

1.2.3 HER-2基因扩增 采用荧光原位杂交法。常规石蜡标本切片，脱蜡、水化，30%酸性亚硫酸、SSC缓冲液冲洗，蛋白酶K漂洗，0.1 mmol/L HCl漂洗，酒精脱水，丙酮浸泡3 min，将10 μL变性的DNA探针混合物与样本杂交，盖玻片覆盖后置于42℃湿盒中孵育过夜，用50%甲酰胺和SSC缓冲液各冲洗3次，冲洗后滴加10 μL DAPI复染细胞核，400倍光镜下观察。正常细胞核存在1个绿色和1个红色信号。若单个细胞核中红色≥2个，但红色信号/绿色信号值(50个细胞核)＜1.8为无HER-2基因扩增;1.8～2.2为可疑，需增加选择计数的细胞数至100个;＞2.2为基因扩增阳性。

1.2.4 相关性分析及与临床病理参数的关系 分析HER-2蛋白表达、基因扩增与VM的相关性，分析三者与乳腺癌患者临床病理参数的关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件分析数据，两组计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用四格表χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VM病理观察 由肿瘤细胞围成的不规则管道样结构，无内皮细胞衬覆，CD34染色阴性，PAS阳性，可见淡红色基底膜，管腔内存在红细胞，周围无炎性或坏死组织。乳腺癌组织中VM总阳性率为49.0%(98/200)。

2.2 HER-2蛋白表达及基因扩增情况 乳腺癌组织中HER-2蛋白阳性率和基因扩增率分别为67.5%(135/200)、19.0%(38/200)。

2.3 HER-2蛋白表达、HER-2基因扩增、VM阳性率与临床病理参数的关系 HER-2蛋白表达及HER-2基因扩增与肿瘤直径和组织学分级相关(P均＜0.05)，VM阳性与淋巴结转移和组织学分级相关(P均＜0.05)。见表1。

表1 HER-2蛋白表达、HER-2基因扩增、VM与乳腺癌临床病理特征的关系(例)

2.4 HER-2表达、基因扩增与VM的关系 乳腺癌VM阳性组中，HER-2蛋白及基因扩增阳性率明显高于VM阴性组(P均＜0.05)，见表2。

3 讨论

长期以来，内皮细胞形成的新生血管被认为是肿瘤细胞获得血液支持的惟一途径。但近年研究发现，单纯的抗肿瘤性血管形成治疗并没有显著改善患者的预后，仍有半数以上患者存在复发而死亡［4］。VM是近年来提出的全新的肿瘤性血管形成模式，是独立于内皮细胞形成血管的另一种肿瘤性微循环模式，具有运输血液和营养物质的功能，但没有内皮细胞衬覆，由肿瘤细胞围绕形成不规则管道，可与宿主的微血管相通，从而满足肿瘤的恶性生长、侵袭的需要，为肿瘤细胞的远处转移提供机会［5］。研究表明，在人体多种肿瘤如肝癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和黑色素瘤中均存在VM的表达［6～8］。张旭等［9］研究发现，VM阳性的乳腺癌患者远期生存率明显低于VM阴性患者，复发率明显高于VM阴性患者。导致这一现象的原因可能是VM阳性患者肿瘤细胞更容易进入血液系统发生远处转移，患者预后差。此外，可以形成VM的肿瘤组织恶性程度比较高，分化低，更具有未分化或分化不成熟的表现［10］。本研究发现，在200例乳腺癌组织中VM阳性率为69.0%，VM阳性与乳腺癌患者淋巴结转移和组织学分化程度密切相关，而与乳腺癌患者年龄、肿瘤大小等无明显相关。

表2 HER-2表达、基因扩增与VM的关系(例)

HER-2是参与肿瘤生长、分化和侵袭转移等生物学行为的重要因子。研究发现，乳腺癌组织中HER呈高表达，并参与肿瘤的增殖与凋亡［11］。本研究发现，乳腺癌组织中HER-2蛋白阳性率和基因扩增率分别为67.5%和19.0%，两者均与肿瘤大小和组织学分级相关，而与患者年龄和淋巴结转移无关;另外，本研究发现，HER-2与VM存在密切相关性，VM阳性者中HER-2阳性表达率明显高于VM阴性者，提示HER-2可以通过激活下游相关基因促进与VM相关的分子表达。国外有研究通过体外实验证实，在HER-2基因存在的情况下，肿瘤细胞可围绕形成血管样，而敲除HER-2基因后，肿瘤细胞相关的VM则不能形成或形成能力较弱［12，13］。研究认为其可能机制是HER-2通过活化酪氨酸激酶，促进细胞内信号传导，激活相关基因，并促进细胞糖代谢、氧运输和肿瘤性血管形成过程中的相关靶基因，从而通过启动一系列分子事件，促使肿瘤不断形成肿瘤性血管以保证肿瘤生长所需的血液供应，促进VM形成［14］，因此，HER-2可能是 VM 形成和肿瘤恶性生长的促进因素。

目前关于HER-2促进VM的具体机制尚不清楚，本研究后续将从细胞学水平进一步研究，为乳腺癌提高更新的诊疗思路。

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