发酵中草药对免疫功能低下小鼠的保护作用研究

谢全喜，赵 攀，王文春，张 文，王晓芳，张建梅*

（1.山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东 泰安 271000；2.山东省济南育贤中学，济南 250022）

环磷酰胺（CTX）是一种细胞毒化疗药物，同时也属于烷化剂类免疫抑制剂，其作用主要是通过与DNA双链交叉连接破坏DNA结构，从而阻断其复制，破坏免疫活性细胞，抑制其免疫性能[1]。CTX是已知最强的烷化剂类免疫抑制剂，对体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫有很强的免疫抑制作用[2-3]。在免疫调节药物的研究中，CTX经常被用来制备非特异性免疫功能低下模型。现代医学研究结果表明，很多中草药含有多糖类、有机酸类、生物碱类和挥发油类等物质，这些物质能够提高动物机体的免疫力。紫茎泽兰脱毒草粉的有效成分绿原酸具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤及增强免疫力的作用。板蓝根具有抗菌、抗病毒及提高免疫力等作用，有研究发现，板蓝根多糖能增强抗体形成细胞功能，增强小鼠静脉注射碳粒廓清速率。紫锥菊提取物可以作为免疫调节剂，增强机体免疫力。发酵中草药是将天然中草药提取液用益生菌对其进行发酵，经过微生物转化成为能够被机体肠道直接吸收的小分子成分，使中草药成为快速吸收、定量疗效的新型药物。本试验将3种中草药联合，用芽孢菌7348对其进行发酵，研究其对CTX免疫抵制小鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

清洁级纯系昆明小白鼠，体重20±2 g，雌雄各半，由山东鲁抗动物实验中心提供。

1.2 试验材料

CTX由山西泰盛制药有限公司提供；中草药紫茎泽兰脱毒草粉购自昆明科宝饲料科技有限公司；紫锥菊末购自齐鲁动物保健品有限公司；板蓝根购自泰安市永春堂永兴药店；芽孢菌7348为山东宝来利来生物菌种保藏中心保存。

准确称取紫茎泽兰脱毒草粉5 g、板蓝根2 g和紫锥菊3 g，溶于100 mL蒸馏水中，盛放于500 mL三角瓶中，121℃灭菌30 min。按活菌数106cfu·mL-1接种芽孢菌7348，振荡培养48 h，镜检芽孢脱落＞95%。将发酵液在45℃烘箱中烘干，用研钵研磨备用。

1.3 试验方法

1.3.1 免疫低下模型的建立及给药

将100只昆明小鼠预饲3 d后随机分为5组，每组20只，雌雄各两个重复，每个重复5只，各重复小白鼠分笼饲喂基础饲粮。分别为正常组、模型组及发酵中草药低、中、高剂量组，中草药组用发酵中草药水溶液灌胃，剂量分别为100、200和400 mg·kg-1（灌胃剂量按小白鼠的采食量计算），1次·d-1，连续20 d。正常组和模型组灌胃蒸馏水。在灌胃的第5天开始，除正常组外，模型组和发酵中草药组均腹腔注射CTX 40 mg·kg-1·d-1，连续5 d。

1.3.2 免疫器官指数

检测末次给药24 h后，称量小鼠体重，断颈处死，分离脾脏和胸腺，迅速剥离脂肪和其他结缔组织后，滤纸吸净脏器表面血污，称重。计算脾脏指数和胸腺指数，免疫器官指数计算公式见式1。

1.3.3 血清生化指标

末次给药24 h后，小鼠眼球取血，3 000 rpm离心10 min分离血清，用全自动生化分析仪测定谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）含量。

1.3.4 单核-巨噬细胞吞噬功能

末次给药24 h后，称量小鼠体重，按剂量0.1 mL·10 g-1给各小鼠尾静脉注射印度墨汁20%；注射后2和20 min分别从小鼠的左眼眶和右眼眶取血20μL，加入0.1%NaCO3溶液10 mL，摇匀，于600 nm处测光密度值（OD值）；为校正因各小鼠脾脏、肝脏质量不同产生的差异，取血完毕后，断颈处死小鼠，取肝脏、脾脏，用滤纸吸净脏器表面血污，称重。廓清指数和吞噬指数计算公式见式2～3。

式中，OD1、OD2分别为2和20 min时，取血测得的光密度值，t2、t1为注射印度墨汁后采血时间。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 13.0统计分析采用Oneway ANOVA进行方差分析，LSD法进行组间多重比较，结果均以“平均值±标准误”表示。

2 试验结果

2.1 对小鼠免疫器官指数的影响

各组小鼠脾脏的变化见附图。

附图 发酵中草药对小鼠脾脏的影响

由附图可见，2-模型组小鼠脾脏与1-正常组和中草药组小鼠脾脏相比，体积显著缩小，而3个发酵中草药组脾脏体积变化不显著。

发酵中草药对小鼠免疫器官指数的影响见表1。

表1 发酵中草药对小鼠免疫器官指数的影响mg·kg-1

由表1可知，与正常组相比，模型组和发酵中草药高、中、低剂量组的脾脏指数和胸腺指数均极显著降低（P＜0.01）；而与模型组相比，发酵中草药高、中、低剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的脾脏指数（P＜0.05），同时极显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数（P＜0.01），其中以中剂量发酵中草药效果最佳，脾脏指数和胸腺指数分别比模型组高20.31%和71.64%。

2.2 对小鼠血清生化指标的影响

发酵中草药对小鼠血清生化指标的影响见表2。

表2 发酵中草药对小鼠血清生化指标的影响

由表2可知，与正常组相比，模型组ALT、AST和BUN含量均极显著高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，发酵中草药给药组ALT和AST含量显著低于模型组（P＜0.05），且BUN含量极显著低于模型组（P＜0.01）。在降低AST和BUN含量方面，发酵中草药中剂量组添加效果最佳，分别降低11.52%和12.92%。

2.3 发酵中草药对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

发酵中草药对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响见表3。

表3 发酵中草药对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

由表3可知，与正常组相比，模型组和发酵中草药3个剂量给药组廓清指数和吞噬指数均极显著降低（P＜0.01），而3个给药组的吞噬指数显著将降低（P＜0.05）；发酵中草药3个剂量给药组的廓清指数和吞噬指数均显著高于模型组（P＜0.05），其中以中剂量组效果最好，分别提高54.88%和27.85%。

3 讨论

3.1 对小鼠免疫器官指数的影响

胸腺和脾脏分属于中枢免疫器官和外周免疫器官，胸腺是T淋巴细胞成熟的场所，脾脏是成熟淋巴细胞和B细胞定植的场所，胸腺指数和脾脏指数可直观的反映机体免疫功能的强弱[4-5]。受抗原刺激后，参与免疫的T细胞、B细胞和巨噬细胞大量增生，促进免疫器官发育；但受到免疫抑制影响时，淋巴组织萎缩，导致免疫器官体积缩小，免疫器官指数降低[6]。本试验中小鼠灌服发酵中草药后，3个给药剂量组均可使CTX造成的胸腺萎缩小鼠的胸腺指数极显著提高（P＜0.01），同时显著提高脾脏指数（P＜0.05），虽然未恢复到正常水平，但显示出其对CTX造成的免疫低下小鼠脾脏和胸腺的保护作用，其中以中剂量组添加效果最佳。

3.2 对小鼠血清生化指标的影响

ALT和AST活性是反映肝脏和心脏功能的重要指标。在正常情况下，这些酶主要存在于肝细胞中，血液中含量很少，只有在肝脏受损时才会大量释放进入血液，所以血清中ALT和AST被认为是肝细胞受损伤最敏感的指标。BUN是体内氨基酸分解代谢的终产物之一，是反映机体营养状况及蛋白质代谢的重要指标。一般认为血清BUN水平反映饲料蛋白利用的情况。血清BUN水平升高表示蛋白质分解加强，降低表示蛋白质合成增加。本试验结果表明，中剂量给药组ALT和AST含量显著高于正常组（P＜0.05），且BUN含量极显著高于正常组（P＜0.01），但ALT、AST和BUN含量均显著低于模型组（P＜0.05）。说明添加发酵中草药200 mg·kg-1对CTX造成的小鼠肝脏受损有一定程度的恢复作用。

3.3 对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响

单核巨噬细胞系统是机体最重要的防御系统，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一，可以借助测定血流中碳粒的消失速度来反映单核巨噬细胞吞噬异物的能力。小鼠碳粒廓清实验是检验机体非特异性免疫的方法之一，本实验中20%的印度墨汁作为一种外来抗原，经小鼠尾静脉注射进入血液循环，迅速流经肝脏与脾脏，墨汁碳粒会被单核吞噬细胞所清除，清除率可反映单核吞噬细胞的吞噬功能，吞噬指数越高，单核吞噬细胞的吞噬能力越强。周琼等用环磷酰胺致低免疫力小鼠作为模型，再分别用低、中、高剂量的美洲大蠊粉给小鼠灌胃，研究虫粉对小鼠吞噬细胞的吞噬指数、血清溶血素含量、外周血CD4/CD8和免疫器官指数的影响，结果表明，高剂量虫粉组的血清溶血素含量和外周血CD4/CD8与模型对照组相比均有显著提高（P＜0.05），中、高剂量虫粉组吞噬细胞的吞噬指数比模型对照组显著提高（P＜0.05），说明美洲大蠊虫粉能提高低免疫力小鼠的免疫功能[7]。本试验结果表明，3个给药组廓清指数极显著低于正常组，且吞噬指数显著低于正常组，但3个剂量给药组的廓清指数和吞噬指数均显著高于模型组，其中以中剂量组效果最好。说明发酵中草药200 mg·kg-1可以提高免疫抑制小鼠的廓清指数和吞噬指数，对CTX导致的免疫功能低下有一定的恢复作用。

4 结论

本试验结果表明，发酵中草药不同剂量均能够显著提高CTX造成的免疫低下小鼠脾脏指数和胸腺指数，同时降低血液中ALT、AST和BUN含量，显著提高免疫抑制小鼠的廓清指数和吞噬指数，其中以中剂量组200 mg·kg-1添加效果最好。

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