去细胞神经支架联合VEGF 修复周围神经缺损的实验研究

潘富文，吴林清

(海南省农垦三亚医院骨科，海南三亚 572000)

·论著·

去细胞神经支架联合VEGF 修复周围神经缺损的实验研究

潘富文，吴林清

(海南省农垦三亚医院骨科，海南三亚 572000)

目的观察去细胞神经支架联合血管内皮生长因子(VEGF)在促进周围神经损伤修复中的作用。方法购买雄性Wistar大鼠60只，先取15只成年Wistar大鼠作为神经供体，制备去细胞神经支架，将制备好的神经支架剪取长度约为1 cm的去细胞神经基膜管。根据实验要求，将余Wistar大鼠随机分为三组，每组大鼠均15只。实验组(A组)为去细胞神经支架移植+局部注射VEGF组；对照组Ⅰ(B组)为去细胞神经支架移植组；对照组Ⅱ(C组)为自体神经移植组。术后喂养1个月，并每日观察大鼠步态、患足溃疡恢复情况。术后1个月取移植段坐骨神经组织行HE染色、免疫组化染色观察再生神经S-100及轴突数量，髓鞘、神经纤维数等生长情况。结果术后1个月，三组大鼠的足部溃疡、步态均有不同程度的恢复，其中实验组恢复率接近于自体神经移植组，明显优于单纯去细胞神经支架移植组；A组的再生神经轴突数为(125.34±5.67)，B组再生神经轴突数为(62.32±3.71)，C组再生神经轴突数为(132.55±7.48)，A组与C组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，A组与B组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论去细胞神经支架联合VEGF在促进周围神经损伤修复过程中可能具有一定的作用。

神经修复；神经支架；周围神经；化学去细胞

周围神经损伤是手足显微外科的常见病、多发病，其损伤后修复一直以来是治疗的难点。即使患者经过较为科学的治疗，患肢功能得到了较大程度的恢复，但仍然留下不同程度的后遗症，给患者日后的正常生活带来巨大的不便。因此，提高周围神经损伤的诊断及治疗，恢复其功能，提高生活质量已成为临床医师研究和关注的焦点[1]。随着现代医学组织工程学研究的深入发展，许多学者已经意识到一些材料、生长因子及细胞在神经修复过程中发挥着一定的作用。血管内皮生长因子(VEGF)作为血管生成微肽类蛋白，可以促进血管的再生，增加血管壁的通透性，能通过改善微循环间接地起到神经保护作用，同时也可以作为一种神经营养因子对神经系统起到维持与保护的作用[2-3]，而去细胞神经支架具有良好的完整性，组织相容性及生物力学稳定性。笔者为此将二者联合应用于大鼠周围神经损伤的治疗中，以探讨该组织工程神经在神经修复中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠60只(海南医学院动物饲养中心提供)，体重(250±25)g，选取45只随机分为A、B、C三组，每组15只；另外15只作为坐骨神经供体。

1.1.2 主要试剂与材料 VEGF(30 μg/ml)溶液购自武汉博士德生物技术有限公司，曲拉通100 (Triton-100)购自北京翰谱医药生物研究所，脱氧胆酸钠购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学染色超敏试剂盒(S-P超敏试剂盒鼠/兔)购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法 A组为实验组，采用去细胞神经支架移植+局部注射VEGF治疗，B组仅采用去细胞神经支架移植组，C组仅采用自体神经移植。先用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射，麻醉成功，取大腿后侧入路，直视下依次切开皮肤，皮下，分离肌肉，显露坐骨神经，在放大10倍的手术显微镜下，分别对三组大鼠组进行造模。用10-0显微缝线，等间距缝合神经外膜，术后在实验室条件下饲养大鼠1个月，术后A组每日按时在臀大肌注射浓度为VEGF(30µg/ml)[4]的液体5 ml，并观察、记录大鼠的步态、伤口愈合、足底溃疡愈合等情况，并行组织形态学观察。

1.3 HE染色 切取厚度为4～5 μm的石蜡切片，并烤干(时间约为2 h)。①脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置10 min；②脱水：无水乙醇梯度脱水后置于蒸馏水洗3～5 min。③染色：染色、返蓝各2 min。④水洗：再次用梯度乙醇水洗脱水。⑤封片：光镜下观察。

1.4 免疫组化染色①切片脱蜡至用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗3次，每次3 min。②进行组织抗原相关修复。③每张切片滴加1滴过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。④除去PBS液，每张切片滴加1滴正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10 min。⑤除去血清，每张切片滴加1滴的第一抗体(S-100)，2 h后用PBS冲洗3次，每次3～5 min。⑥除去PBS液，每张切片滴加1滴生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。⑦除去PBS液，每张切片滴加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。⑧除去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min，显色合适后即刻进行先一步。⑨自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察结果 术后4周，A组与C组大鼠足部红肿及溃疡基本完全愈合，步态基本恢复正常，双后足能站立。B组恢复相对较差，仍有7只患足溃疡未愈。取材行组织学观察时见各组移植神经组织轻度粘连，A组、C组神经移植物表面毛细血管网清晰可见，移植物近端稍稍膨大，远端塌陷较轻，神经移植物的连续性及结构的完整性较为良好，而B组移植物塌陷相对较为严重，见图1～图4。

2.2组织学HE染色结果术后4周，A、C组再生雪旺细胞数量较多，神经纤维束呈圆形或椭圆形，整齐排列。纤维束周边有大量的新生毛细血管，A组与C组有髓神经纤维数量多，髓鞘及轴突清晰可见，排列整齐，密度均匀，髓鞘厚度均一，明显优于B组，见图5～图7。

2.3 组织学免疫组化染色结果术后4周，S-100蛋白纵、横切片染色均呈棕黄色，A组、C组切片着色均匀、基本一致，雪旺细胞数量较多，排列整齐，仅仅环绕于神经鞘管周围，细胞大小基本一致。而B组切片着色较淡，雪旺细胞数量相对较少，细胞大小形态不一，雪旺细胞排列较疏松，见图8～图10。

2.4 图像分析结果术后4周，A、B、C组再生神经纤维数量、轴突数比较，A组和C组均优于B组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而A组和C组两组间比较差异则无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 术后4周各组再生神经纤维数、轴突数比较（n=15，，只/HP)

表1 术后4周各组再生神经纤维数、轴突数比较（n=15，，只/HP)

注：与A组比较，aP＜0.05，bP＞0.05；cP＜0.05，dP＞0.05。

3 讨论

一直以来自体神经移植都被认为是神经修复的最佳方法，该方法犹如拆西墙补东墙，也存在问题，如供区皮肤感觉障碍、神经痛、瘢痕形成等。周围神经组织工程研究包括神经支架、生长因子、细胞及两者或者三者相互作用。去细胞神经具备神经再生的天然三维结构及细胞外基质，免疫原性低，具有良好的应用前景[5]。雪旺细胞作为周围神经组织工程的种子细胞能分泌多种神经营养因子、细胞外基质，其在周围神经再生中的重要作用已被广泛证实[6]。VEGF可促进移植物的毛细血管生成，为雪旺细胞的存活，神经元、轴突长时间存活提供了较为理想的基础环境，作为一种神经保护因子，可直接或者间接地促进神经元、轴突及髓鞘等生长，促进轴突再生，启动并激活雪旺细胞延伸、增殖与分化，进而促进神经的再生修复[2，7]。之前许多学者研究已经证实，组织工程神经具有存进神经修复的作用。本实验借鉴他人的研究经验，将去细胞神经支架移植于大鼠坐骨神经缺损处，实验组外加注射VEGF。结果显示，神经支架移植+局部注射VEGF组，在步态恢复、足部溃疡的恢复上明显优于单纯神经支架移植组，接近于自体神经移植组。说明去细胞神经支架联合VEGF具有促进周为神经修复再生的作用。

本实验引入的是同种异体去细胞神经支架，该神经支架具有免疫原性低、组织相容性、稳定性、三维仿生性等。为神经修复再生营造一个相对稳定的再生微环境及营养物质交换的场所，为雪旺细胞再生、轴突再生、神经纤维束植入奠定良好的基础。近年来研究表明，VEGF可以促进神经微小血管的生成，同时也具有营养神经的作用，可被视为一种神经营养因子。可以促进施旺细胞增生，神经轴突突起的长度，促进神经损伤后的再生及功能恢复[8]。在神经导管内加入VEGF，可以提高神经移植修复的疗效，并且VEGF对某些代谢毒素引起的神经损害具有一定的逆转及保护作用[9-10]。Pereira Lopes等[11]在实验研究中实验组引入了VEGF治疗SD大鼠坐骨神经缺损，对照组单纯注射等剂量的生理盐水，实验结果证实，实验组神经修复效果明显优于对照组。本实验术后4周，行组织形态学观察，神经支架移植+局部注射VEGF组和自体神经移植组再生雪旺细胞数量较多，神经纤维束呈圆形或椭圆形，整齐排列。纤维束周边有大量的新生毛细血管，神经支架移植+局部注射VEGF组和自体神经移植组有髓神经纤维数量多，髓鞘及轴突清晰可见，排列整齐，密度均匀，髓鞘厚度均一，明显优于单纯神经支架移植组。S-100蛋白纵、横切片染色均呈棕黄色，神经支架移植+局部注射VEGF组和自体神经移植组雪旺细胞数量较多，排列整齐，仅仅环绕于神经鞘管周围，细胞大小基本一致。而单纯神经支架移植组雪旺细胞数量相对较少，细胞大小形态不一，雪旺细胞排列较疏松。结果与许多学者的研究结果不谋而合。说明神经支架移植+局部注射VEGF具有一定的促进神经雪旺细胞增殖、分化以及促进神经修复的作用。

周围神经损伤后在修复过程中，雪旺细胞的增殖与分化起着决定性的作用，雪旺细胞在增殖的过程中分泌各种神经营养因子，而它们会正反馈的促进雪旺细胞围绕着神经微丝外围生长，形成髓鞘，进而为神经微丝、微管及轴突的延伸营造了良好的环境。本实验术后4周，组织形态学结果较好的诠释了大体观察大鼠步态、足部溃疡的恢复情况。但依然存在一些诸如神经支架远端的塌陷是否影响神经轴突的再生等问题，这些问题仍有待于日后的研究逐步解决。

[1]吴林清,殷超,王继宏,等.周围神经损伤后修复再生的研究进展[J/D].中华临床医师杂志(电子版),2014,8(7):1338-1341.

[2]何永志,林斌.血管内皮生长因子在神经系统中的作用[J].临床骨科杂志,2012,15(5):569-572.

[3]张烨,谢琳,房萍,等.成年斑马鱼脊髓修复中脑内VEGF基因的表达变化[J].延安大学学报(医学科学版),2013,11(3):12-16.

[4]陈灵丽,任明山.VEGF在POEMS综合征发病中的作用及相关治疗的研究进展[J].安徽医学,2014,35(1):127-129.

[5]杨润功,衷鸿宾,朱加亮,等.去细胞同种异体神经移植修复周围神经缺损临床安全性研究[J].中华外科杂志,2012,50(1):74-76．

[6]蒋良福,劳杰,何继银,等.几丁糖胶原复合膜及激活态雪旺细胞修复周围神经缺损的实验研究[J].中华手外科杂志,2005,21 (3):172-174．

[7]蒋良福,陈鸥,虞庆,等.预血管化组织工程神经修复周围神经缺损的研究[J].中华手外科杂志,2014,30(3):216-219.

[8]Ling C,Chen KC,Hsieh PS,et al.Neurotrophic effects of vascular endoth elial growth factor and neurotrophins on cultu red major pelvic ganglia[J].BJU Int,2003,92(6):631-635.

[9]Kim BS,Yoo JJ,Atala A.Peripheral nerve regeneration using acellular nerve grafts[J].J Biomed Mater Res A,2004,68(2):201-209.

[10]Kirchmair R,Tietz AB,Panagiotou E,et al.Therapeutic angiogenes is inhibits or rescues chemotherapy-induced peripheral neuropathy: taxol-and thalidomide-induced in jury of vasa nervorum is ameliorated by VEGF[J].Mol Ther,2007,15(1):69-75.

[11]Pereira Lopes FR,Marin PK,Frattini F,et al.Double gene therapy with granulocyte colony-stimulating factor and vascular endothelial growth factor acts synergistically to improve nerve regeneration and functional outcome after sciatic nerve injury in mice[J].Neuroscience,2013,230:184-197.

Experimental research of acelluar nerve scaffold in combination with VEGF in the treatment of peripheral nerve defect.

PAN Fu-wen,WU Lin-qing.Department of Orthopedics,Sanya Land Reclamation Hospital,Sanya 572000,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF in combination with acellular nerve scaffold on repairing peripheral nerve defect.MethodsSixty male Wistar rats were bought,15 of which were selected as nerve donors.The acellular nerve scaffolds were prepared and then cut into 1 cm acellular nerve basal laminas.According to experimental design,the rest 45 rats were randomly divided into three groups,with 15 in each group.Group A(the experimental group)was treated with both VEGF and acellular nerve scaffolds transplantation,group B(control groupⅠ) with just acellular nerve scaffolds transplantation,group C(control groupⅡ)with nerve autograft.After surgery,the recovery of the rats'gait and plantar ulcer were observed every day.After one month of the surgery,the regenerative nerves'S-100 protein,number of axon,growth of myelin sheath and nerve fiber were observed by HE staining and immunohistochemical staining of the transplanted sciatic nerve tissue.ResultsOne month after the surgery,the three groups showed different recovery levels of the rats'gait and plantar ulcer.The recovery rate of group A was close to that of group C,but significantly higher than that of group B.The number of regenerative nerve axon of group A,B and C was(125.34±5.67),(62.32±3.71),and(132.55±7.48),respectively.They were no statistically significant difference between groupAand group C(P＞0.05),while the difference between groupAand group B was statistically significant(P＜0.05).ConclusionVEGF in combination with allogenic acellular nerve can help repairing peripheral nerve defect.

Nerve repair;Nerve scaffold;Peripheral nerve;Chemically acellular

R-332

A

1003—6350（2014）22—3283—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1289

2014-09-06)

潘富文。E-mail：724269424@qq.com