RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量

郭红霞 谢文剑 曹 艺 潘清平，▲

1.湖南省常德市第一人民医院药剂科，湖南常德 415000；2.湖南中医药大学药学院，长沙 410208

RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量

郭红霞1谢文剑2曹 艺2潘清平1，2▲

1.湖南省常德市第一人民医院药剂科，湖南常德 415000；2.湖南中医药大学药学院，长沙 410208

目的 建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定桑叶中活性成分绿原酸的方法。 方法 采用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长为325 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃，进样体积10 μl。 结果 绿原酸的线性范围为0.3890～7.771 μg（r=0.9994），平均回收率为98.91%。 结论RP-HPLC检测效率高，专属性强，重复性好，可用于桑叶中绿原酸的定量测定，可作为该药材的质量控制方法之一。

桑叶；绿原酸；质量控制；反相高效液相色谱法

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功效。主要用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花[1]。现代药理研究表明桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-4]。对桑叶的质量控制研究大部分围绕中桑叶中的活性成分芦丁来进行相应的含量测定[5-6]，也有的围绕黄酮类成分进行相应质量控制研究[7]。目前，国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，且本课题组在前期指纹图谱研究中发现绿原酸也是桑叶中的主要活性成分之一[8]，因此为了进一步控制桑叶质量，本研究采用反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对从全国收集的桑叶药材进行绿原酸含量测定研究，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters公司）。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，冰乙酸（色谱纯，北京化工厂）。

1.3 对照品及样品

对照品绿原酸购于中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号110753-200413），不同产地的桑叶药材，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μl；流动相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：0→20 min，9%A→18%A。按照上述色谱条件，待测成分绿原酸分离很好，无干扰，得色谱图1。

图1 对照品绿原酸和样品桑叶的RP-HPLC图

2.2 供试品制备

取桑叶粉（80目）约1 g置50 ml三角瓶，精密称定，加甲醇20 ml，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，RP-HPLC分析。

2.3 对照品制备

精密称取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到浓度为0.3890 μg/μl的对照品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取“2.3”项下的绿原酸对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 μl进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（μl）为横坐标（X），得绿原酸的线性回归方程分别为：Y= 182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 μg）。

2.5 精密度

取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC分析条件，连续进样6次，计算绿原酸峰面积，结果表明，峰面积RSD值＜0.65%。

2.6 重现性

一份固定粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC分析，考察绿原酸峰面积，峰面积的RSD值＜1.02%，表明方法的重现性在误差范围内。

2.7 稳定性

制备药材供试品溶液后，在室温下放置不同时间，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进行RP-HPLC分析，以绿原酸的峰面积计算，考察样品的稳定性，主要成分的峰面积在48 h内RSD值＜1.24%，表明样品至少在48 h内是稳定的。

2.8 回收率试验

取同一批已知含量的桑叶药材样品约0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量绿原酸对照品溶液，按“2.2”项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率（表1）。从表1中可知，样品的平均回收率为98.91%，RSD为0.84%，表明回收率符合要求。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 含量测定

按照上述色谱条件，将不同产地的样品进行处理和进样，每一个相同产地及批号的样品测3份，采用外标两点法计算桑叶中绿原酸的平均含量（表2）。从表2中可知，不同产地的桑叶药材绿原酸含量均在0.25%以上，最高的可达0.90%，提示绿原酸确实为桑叶中的一个主要成分。

表2 桑叶药材来源及其绿原酸含量的测定结果（n=3）

3 讨论

本实验根据定量化合物为酚酸，在甲醇中有较好的溶解度，选择甲醇超声，处理容易、可控；且样品呈酸性，选择醋酸水溶液作为水相，水相中醋酸比例是通过单因素多水平试验确定最佳比例为1.0%。选择乙腈作为有机相来分析中药复方，柱压稳定且较低，有利于保护仪器和色谱柱。波长选择325 nm也是基于所测化合物在该波长处吸收最大，且杂质干扰较少。梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

含量测定结果表明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与目前药典中收载的芦丁含量相比，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因此建议药典桑叶标准中增加绿原酸含量测定。

在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个明显的色谱峰，课题组下一步准备分离制备这些色谱峰，进行相应结构鉴定和富集，为下一步开展桑叶中主要成分含量测定及其活性测试奠定基础。

中药质量标准是一个系统工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，只是其质量标准的一个部分。其中，影响桑叶中绿原酸含量的因素很多，如产地、初加工、采收季节等，因此，只能把绿原酸作为评价桑叶质量的指标之一，应该建立更为系统、全面、体现中药特点的桑叶质量标准。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：279.

[2]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学，2005，31（4）：418-421.

[3]陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药，2011，42（3）：515-520.

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[5]雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志，2012，22（3）：468-469.

[6]周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.

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[8]姚江雄，李春，廖端芳，等.桑叶药材HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：119-121.

[9]李贻奎，李连达.从复方丹参制剂的混乱看中药标准化的迫切性与必要性[J].中国中药杂志，2008，33（4）：349-354.

Determination of chlorogenic acid in Molberry leaf by reverse phase high performance liquid chromatography

GUO Hong-xiao1XIE Wen-jian2CAO Yi2PAN Qing-ping1，2▲
1.Department of Pharmacy,the First People′s Hospital in Changde City of Hunan Province,Changde 415000,China; 2.College of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China

ObjectiveTo establish a method for determining chlorogenic acid,salviaflaside in Mulberry leaf by reverse phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC).MethodsThe separation was performed on a Kromasil-C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm)with gradient elution using acetonitrile-1.0%acetic acid as mobile phase.The detection wavelength was 325 nm and the column temperature was 30℃with the flow rate of 1.0 ml/min,the sample injection was 10 μl.ResultsLinear ranges of chlorogenic acid was 0.3890-7.771 μg(r=0.9994),respectively.Its average recoveries was 98.91%.ConclusionThe RP-HPLC method established in this experiment can be used to determine the contents of chlorogenic acid in Mulberry leaf.The method can also be used as the standard for the quality control of Mulberry leaf because of simplicity,reliability and accuracy.

Mulberry leaf;Chlorogenic acid;Quality control;Reverse phase high performance liquid chromatography

R286.0

A

1674-4721（2014）02（a）-0017-03

2013-12-03本文编辑：郭静娟）

▲通讯作者：潘清平，男，教授，硕士研究生导师，研究方向为中药鉴定与质量控制