应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6的含量

郑悦康 叶志英 刘绮明

广东省中山市疾病预防控制中心，广东中山 528400

应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6的含量

郑悦康 叶志英 刘绮明

广东省中山市疾病预防控制中心，广东中山 528400

目的 建立应用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6含量的分析方法。 方法 采用维生素B6微生物检测试剂盒定量检测奶粉中添加维生素B6的含量。 结果 维生素B6的线性范围为0.002～0.012 mg/100 g（ml），检出限为0.002 mg/100 g（ml），其标准曲线的相关系数为0.9987，相对标准偏差均<10%，其回收率达到90.0%～108%。 结论 微生物法试剂盒具有灵敏度高，检出限低，线性范围宽，操作方法简便、快捷，结果准确可靠等优点，可用于奶粉中维生素B6的检测工作。

维生素B6；吡哆醇；微生物法

维生素B6是所有呈现吡哆醛生物活性的3-羟基-2-甲基吡啶衍生物的总称，主要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界广泛分布，其磷酸化形式是氨基酸代谢过程的辅酶，如转氨酶的辅酶。加入食品中的维生素B6通常为盐酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇形式，5-磷酸吡哆醇也以维生素B6衍生物的形式天然存在于食品中。主要临床应用有：维生素B6缺乏症、婴儿惊厥、血红蛋白缺陷所致的贫血、放射病及某些抗癌药物引起的恶心、呕吐或妊娠呕吐的治疗[1]。据报道每天补充40 mg维生素B6可以防止动脉粥样硬化的发展。研究表明，当维生素B6达到一定血药浓度时，还可以与血小板表面蛋白质、纤维蛋白原及凝血酶原等凝血物质结合，从而阻止血小板聚集，防止血液凝固，延长凝血时间，使血栓不易形成，因而具有预防脑血栓的药理作用[2]。目前，市场上出售的奶粉成分中一般都含有维生素B6，特别在婴幼儿配方奶粉中是必需添加的一种维生素。测定食品中维生素B6的方法有化学法和生物法，化学法主要是仪器分析如液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5]、荧光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其优势则在于：①它是以应用微生物试验对象为基础，测的是生物活性含量，更具生物学意义；②微生物作为一种活试剂，具有自身的特异性和高度的灵敏性，使测定结果较化学方法更为准确。基于这些原因，GB/T5009.154-2003将微生物法规定为测定食品中维生素B6的国家标准方法[10-11]。

本次研究所用的试剂盒利用微生物法的原理，将维生素B6检测培养基和稀释后的样品提取液加入包被有酿酒酵母的微孔中。酿酒酵母的生长离不开维生素B6，加入维生素B6标准品或含维生素B6的样品后，酿酒酵母开始生长直至维生素被完全消耗。30℃避光44～48 h完全孵育。酿酒酵母的代谢或生长强度与提取液中维生素B6的含量有关，可通过在610～630 nm 或540～550 nm下采用酶标仪读取溶液混浊度获得，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中维生素B6含量。

1 材料与方法

1.1 仪器

Sunrise酶标仪（奥地利TECAN）、电子分析天平（上海梅特勒）、离心机（上海安亭）、恒温培养箱（德国BINDER）。

1.2 试剂

VitaFast维生素B6（吡哆醇）检测试剂盒（北京博欧实德生物技术有限公司提供）；盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质（纯度99.7%，中国计量科学研究院生产）；酸性马铃薯磷酸酶（美国Sigma生产）；枸橼酸盐缓冲液（pH4.5）：将1.5 g枸橼酸一水化合物加入100 ml烧杯中，加入50 ml无菌水，边搅拌边溶解，然后加入12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl将pH调至4.5，将溶液定量转移至100 ml容量瓶中，用无菌水定容；实验用水均为灭菌超纯水；样品均为市售奶粉。

1.3 标准样品的制备

1.3.1 标准储备液 准确称取盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度标准物质0.050 g，用枸橼酸盐缓冲液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以备用。

1.3.2 标准工作液 在测定时，将标准储备液按比例用枸橼酸盐缓冲液准确稀释成浓度为10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。

1.4 样品处理

准确称取1 g均质后的样品，将其加入50 ml无菌离心管中，加入20 ml枸橼酸盐缓冲液，振荡混匀，加入10 mg酸性马铃薯磷酸酶，振荡混匀，37℃避光孵育1 h，同时间歇性振荡，用无菌水补至40 ml。振荡混匀后，在95℃水浴中提取30 min，期间应至少混合5次，然后快速冷却至30℃以下，在＞8000 g下离心5 min。根据维生素B6的浓度范围，在1.5 ml无菌离心管中应用无菌水对上清液进一步稀释成100倍或以上，使测定OD值在标准曲线范围内。

1.5 检测步骤

取出所需数量的微孔板条并在板上固定，依次将150 μl维生素B6检测培养基、150 μl标准品或样品稀释液加入微孔中，用黏合箔盖住微孔条或微孔。在30℃培养箱中避光孵育44～48 h。再次向下挤压黏合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中。小心揭开黏合箔，用移液枪头破坏微孔液体表面所有的泡沫。用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度。

1.6 结果计算

应用4参数法进行结果计算。4参数法是指用含有4个参数的方程表示因变量（Y）随自变量（X）变化的规律。目前最常用于免疫检测领域，用于描述吸光度随抗原浓度变化的规律，四参数模式为Y=D+（A-D）/ [1+（X/C）^B]。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

分别移取维生素B6的标准品浓缩液（试剂盒自带）按比例稀释成标准系列浓度分别为0.002、0.004、 0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以标准系列中的维生素B6浓度为横坐标，酶标仪的测量OD值为纵坐标绘制维生素B6的标准曲线（图1）。4参数曲线法线性回归方程为Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/ [1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相关系数为0.9987。

图1 维生素B6的标准曲线

2.2 方法的精密度分析

将进行样品处理的4种不同的奶粉样品分别进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对标准偏差（RSD）值（表1）。

表1 精密度分析（n=6）

2.3 方法的加标回收率

将两种不同的奶粉样品，分别加入质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6标准溶液各10 μl，再按样品处理的步骤进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标回收率（表2）。

表2 加标回收试验（n=6）

3 讨论

由于维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气暴露等环境条件下，会部分降解损失，故在样品提取操作过程中，要尽可能在避光条件下操作，标准溶液应在冷藏、避光条件下保存并尽快分析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，分别于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下测量浑浊度，结果显示48 h内微孔板中的维生素B6性质稳定。

加入微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及实验中需要的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要保证黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分，防止样品液在振荡过程中相互混合影响测量结果。检测样品前要估算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释过程要准确，样品的测量OD值在标准曲线中部的结果可信度较高。

微生物法测定维生素B6的含量近50年来虽然已被广泛地纳入各类国际标准方法中，但在我国应用却很少。微生物法操作繁琐、实验周期长，与目前分析方法简便、快速、高效的发展方向所不符[12]。因此，微生物检测试剂盒通过优化样品处理、试剂配制、反应条件，省略了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化实验步骤，排除实验过程中的各种干扰，从而达到节省实验时间、减轻工作量，进而得到准确的定量结果的目的，同时该方法检出限、线性关系、精密度、加标回收率、稳定性等技术参数能满足奶粉中维生素B6的微量分析的要求，表明该方法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，结果令人满意。

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[3]GB5413-2010.婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定[S].

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The measurement of vitamin B6in milk powder by microbiological method

ZHENG Yue-kang YE Zhi-ying LIU Qi-ming
Zhongshan Center for Disease Control and Prevention in Guangdong Province,Zhongshan 528400,China

ObjectiveTo develop a method of measuring vitamin B6in milk powder by microbiological method.MethodsVitamin B6in the samples of milk powder was measured by vitamin B6quantitative microbial detection kit.ResultsThe standard curve of vitamin B6was linear in the range of 0.002-0.012 mg/100 g (ml)(r=0.9987),and the detection limit was 0.002 mg/100 g (ml).The relative standard deviations of different samples were all below 10%and the recoveries were between 90.0%and 108%.ConclusionMicrobiological method is convenient,rapid and accurate.It can be used to develop a high sensitivity and low detection limit method to measure vitamin B6in milk powder.

Vitamin B6;Pyridoxine;Microbiological method

R155.5

A

1674-4721（2014）02（a）-0012-03

2013-12-02本文编辑：郭静娟）

郑悦康（1979-），男，本科，主管技师，主要从事食品微生物检验工作