桑叶总黄酮不同纯化工艺的比较

林秀仙 罗爱勤 陈 亮

广州白云山汉方现代药业有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州 510240

桑叶总黄酮不同纯化工艺的比较

林秀仙 罗爱勤 陈 亮

广州白云山汉方现代药业有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州 510240

目的 比较桑叶总黄酮不同的纯化工艺，为找到一种总黄酮含量＞15%，简便可行，廉价且适于生产的纯化工艺。 方法 采用D101型、AB-8型和JD-1型大孔吸附树脂吸附法，乙酸乙酯萃取法，醇提水沉法，醇提-水沉-醇沉法6种方法对桑叶总黄酮进行纯化，以总黄酮的收率和含量为考察指标进行评价。 结果6种方法制备的总黄酮的百分含量依次为：50.3%、48.5%、55.7%、82.1%、10.8%、18.5%，产品收率依次为：2.37%、2.42%、2.28%、0.45%、18.21%、15.93%。 结论 采用醇提-水沉-醇沉法即可得到符合要求的桑叶总黄酮。

桑叶；总黄酮；纯化工艺

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶，味甘、苦，性寒，归肺、肝经；具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目的功效；用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花等症[1]。桑叶的生物活性物质主要有黄酮类化合物、生物碱、多糖、桑叶蛋白等[2]，其中黄酮类化合物含有桑色素、芸香苷、槲皮素、异槲皮素、紫云英苷等，含量占干叶重的1.0%～3.0%，是植物中茎叶黄酮类化合物含量较高的一种[3]。黄酮类化合物作为桑叶的重要活性成分之一，具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、防止动脉硬化和抗衰老等功效[4]。桑叶中总黄酮类化合物的常用提取方法是：以浓度约为70%的乙醇为提取溶剂，用浸渍法、超声波法或加热回流法等进行提取[3-7]。本实验以70%乙醇为溶剂，加热回流提取桑叶后，分别考察了不同的纯化工艺，并以总黄酮为考察指标，制备含量达15%以上的桑叶总黄酮，为桑叶总黄酮的进一步开发提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

桑叶（广东广弘药材有限公司，20130701），芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，100080-200707），D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、JD-1型大孔树脂（净品型，天津农药股份有限公司树脂分公司），95%乙醇（医用级），水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

R-201旋转蒸发仪（上海申科机械研究所），YZG-1000A型真空干燥机（常州市范群干燥设备有限公司），BS210S型电子天平（德国赛多利斯），UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司），层析柱（直径2.5 cm×50 cm）。

2 方法与结果

2.1 桑叶总黄酮的纯化方法

2.1.1 桑叶总黄酮的提取 称取桑叶1 kg，加入10倍量70%乙醇，加热回流提取2次，1.5 h/次，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至无乙醇气味，加水稀释至10 L，备用。

2.1.2 D101型树脂吸附法 称取已处理好的D101型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[8-10]。

2.1.3 AB-8型树脂吸附法 称取已处理好的AB-8型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.1.4 JD-1型树脂吸附法 称取已处理好的JD-1型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，加入树脂柱内，控制流速为2～4 ml/min。当溶液全部吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，收集乙醇洗脱液，减压浓缩、干燥，干燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.1.5 乙酸乙酯萃取法 取 “2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，减压浓缩成100 ml，置250 ml分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次用100 ml。合并3次萃取的乙酸乙酯，减压浓缩，转至蒸发皿中，在水浴上将乙酸乙酯挥干，然后真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.1.6 醇提水沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.1.7 醇提-水沉-醇沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩至25 ml，加乙醇使含醇量达70%，搅拌1 min，再于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空干燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品6.33 mg，加乙醇制成每毫升含芦丁0.2532 mg的溶液，即得。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5、 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，分别置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，使混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，应用紫外-可见分光光度法，500 nm波长测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[1]。

结果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈良好的线性关系（表1），得回归方程为Y= 0.3943X+0.0195，r=0.9999。

表1 芦丁标准曲线的绘制

2.2.3 样品含量测定结果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得（表2）。

表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定结果

2.2.4 准确度试验 采用加样回收法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，分别按“2.2.3”方法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。结果表明，回收率均在95%～105%内，RSD= 2.34%（<3%），符合方法学要求。

表3 准确度试验的结果

3 讨论

从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定结果分析，乙酸乙酯萃取法的纯化效果较好，总黄酮含量最高，但是收率太低，说明大部分黄酮类化合物没被保留下来，这样的工艺和结果在实际生产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，但是收率较低，且生产工艺复杂，操作繁琐，不符合工艺简便廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量符合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简便，因此更适于实际生产。

此外，本试验还为生产上制备各种含量的桑叶总黄酮提供了一个参考，根据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：279，372-373.

[2]张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.

[3]薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].中国生化药物杂志，2010，31（6）：405.

[4]贺伟强，向天勇，陶昆，等.响应面法优化超声辅助提取桑叶总黄酮的工艺研究[J].中国农学通报，2012，28（33）：296-301.

[5]励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].分析化学研究简报，2008，36（3）：365-368.

[6]兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研究[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.

[7]章华伟，陈星宇，凌春英.响应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研究[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.

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[9]朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研究[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.

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Comparative studies on different methods of purification of total flavones from Mulberry leaf

LIN Xiu-xian LUO Ai-qin CHEN Liang
Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co,Ltd.National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of TCM,Guangdong Province,Guangzhou 510240,China

ObjectiveTo compare the purification effects of different purification techniques of total flavones from Mulberry leaf.In order to find a purification technology which is cheap,simple,feasible and suitable for the production of total flavones whose purity is more than 15%.MethodsSix purifying methods,including adsorption with macroreticular adsorption resin D101,AB-8,JD-1,extraction with ethylacetate,alcohol sedimentation method,alcohol sedimentation and alcohol precipitation method,were adopted,and the amound and purity of total flavones collected were compared.ResultsBy using the above-mentioned six methods,the percentages of the contents of total flavones was 50.3%,48.5%,55.7%,82.1%, 10.8%and 18.5%respectively,the recoveries of products was 2.37%,2.42%,2.28%,0.45%,18.21%and 15.93%respectively.ConclusionUsing the alcohol sedimentation and alcohol precipitation method can get total flavones up to requirement.

Mulberry leaf;Total flavones;Purification techniques

R284

A

1674-4721（2014）02（a）-0010-03

2013-11-13本文编辑：郭静娟）

广东省科技计划项目（2009A030901008）

林秀仙（1967-），女，制药高级工程师，主要从事中药产业化及生产管理与在产品种技改工作