地五养肝方对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响*

罗俊华 曹秋实

（1.广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

·临床观察·

地五养肝方对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响*

罗俊华1，2曹秋实2

（1.广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070；2.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061）

目的观察地五养肝方对HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子的影响。方法将103例患者随机分为对照组和治疗组，对照组予以恩替卡韦治疗，治疗组在对照组治疗基础上加用地五养肝方。两组共治疗48周。观察两组患者HBV DNA转阴率，检测外周血细胞因子IL-17、IL-10的水平，并用流式细胞技术检测外周血CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞的表达情况。结果治疗48周后，治疗组患者HBV DNA转阴率显著高于对照组（P＜0.05），CD8+水平较对照组明显下降（P＜0.01），CD4+及CD4+/CD8+水平较对照组升高更显著（P＜0.05），IL-17、IL-10水平较对照组降低更明显（P＜0.05）。结论T淋巴细胞和细胞因子在HBeAg阴性CHB的发病及转归中起到非常重要的作用，地五养肝方与恩替卡韦联用能显著改善外周血T淋巴细胞亚群状态，调节细胞因子IL-17、IL-10的水平，提高抗病毒疗效。

地五养肝方 慢性乙型肝炎 HbeAg T淋巴细胞亚群 细胞因子

HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB）相对HBeAg阳性CHB具有病程较长、病情易反复、抗病毒疗效差等特征［1］，是目前研究的热点之一，其病情进展和预后与病毒水平密切相关。T淋巴细胞亚群及相关细胞因子的平衡在机体清除HBV中起到关键性作用［2］。研究表明，中医中药可以改善CHB患者免疫功能，增强西药抗病毒的效果。本研究采用地五养肝方联合恩替卡韦治疗HBeAg阴性CHB，观察治疗前后HBV DNA、IL-17、IL-10及外周T细胞亚群的变化，探讨其作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 病例选择 纳入标准：诊断标准符合2011年《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）［3］；6个月内未使用干扰素及核苷类似物、免疫抑制剂或免疫增强剂。排除标准：合并人类疱疹病毒、巨细胞病毒、HIV感染；合并药物中毒、乙醇中毒等因素所致的肝炎及脂肪肝、自身免疫性肝炎者；同时或重叠感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒者。

1.2 临床资料 收集2011年11月至2013年10月在湖北省中医院肝病中心门诊就诊的HBeAg阴性CHB患者103例。将患者按照随机数字表法随机分为两组。对照组48例，男性30例，女性18例；平均年龄（38.10±13.70）岁。治疗组55例，男性34例，女性21例；平均年龄（37.90±13.20）岁。两组患者在性别、年龄、病程、肝功能等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者对本研究均知情同意，相关程序符合医学伦理学有关标准并取得医院人体试验委员会批准。

1.3 治疗方法 对照组给予恩替卡韦片0.5 mg/d（中美上海施贵宝制药有限公司，商品名为博路定，批准文号为国药准字H20052237，规格为0.5 mg）口服。治疗组在口服恩替卡韦基础上，加用地五养肝方（江阴天江药业有限公司，生产批号12040019，规格为10 g）口服1包/次，每日2次（早晚温开水冲服）。疗程48周。

1.4 观察指标 （1）肝功能及HBV DNA的检测。肝功能检测采用Beckman全自动生化分析仪；HBV DNA定量采用荧光定量PCR法，由专人按照仪器操作规程和试剂盒说明书操作。试剂盒购自武汉博士得生物工程公司。（2）IL-17及IL-10的检测。采用ELISA法，试剂盒购自武汉博士得生物工程公司，按试剂盒说明书操作。（3）T淋巴细胞亚群的检测。采用美国BD公司生产的BD FACScalibur流式细胞仪，检测外周血T淋巴细胞亚群。采集静脉血1 mL，肝素钠抗凝，取流氏管分别加入静脉抗凝全血100 μL及三色标记的单克隆抗体（鼠抗人 CD3-FITC，CD4-APC，CD8-PE，试剂均购自美国BD公司）20 μL，混匀室温避光30 min后加含2.5％胎牛血清（FBS）的磷酸缓冲盐溶液（PBS）2.5 mL，离心洗去多余抗体，破红，再次离心洗涤，弃上清，细胞以10 g/L多聚甲醛重悬，流式细胞仪检测CD3+、CD4+及CD8+T细胞亚群。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验，率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后肝功能比较 见表1。两组治疗后丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及总胆红素（TBIL）水平与治疗前比较均显著下降（P＜0.01）；与对照组治疗后比较，治疗组治疗后ALT、AST及TBIL水平明显降低（P＜0.05）。

2.2 两组HBV DNA阴转情况比较 治疗48周后，治疗组HBV DNA转阴51例（92.7％），对照组转阴37例（77.1％），治疗组HBV DNA阴转率明显高于对照组（P＜ 0.05）。

表1 两组治疗前后ALT、AST及TBIL水平比较（±s）

表1 两组治疗前后ALT、AST及TBIL水平比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.01；与对照组同期比较，△P＜0.05。

组 别ALT（U/L） AST（U/L）TBIL（μmol/L）治疗组 治疗前 43.54±23.71（n＝55）治疗后 21.91±9.70*△对照组 治疗前 46.88±21.57 147.93±51.32 139.85±40.77 49.52±10.32*△ 45.91±11.67*△143.53±47.22 141.16±42.69（n＝48）治疗后 29.47±10.51*57.83±12.45* 54.41±13.83*

2.3 两组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较 见表2。对照组治疗后CD4+及CD4+/CD8+较治疗前均显著增加（P＜0.05），CD3+及CD8+差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组治疗后CD4+及CD4+/CD8+较治疗前均显著增加 （P＜0.01或 P＜0.05），CD8+显著下降 （P＜0.01），CD3+差异无统计学意义（P＞0.05），与同期对照组比较，CD4+及CD4+/CD8+升高更明显（P＜0.05）。

表2 两组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较（±s）

表2 两组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组同期比较，△P＜0.05。下同。

组 别CD3+（％） CD4+（％） CD8+（％） CD4+/CD8+治疗组 治疗前（n＝55）治疗后对照组 治疗前65.21±16.90 29.51±5.10 35.12±5.92 0.84±0.29 67.42±11.21 41.13±6.32**△26.91±4.90**1.54±0.40*△65.53±17.47 29.31±4.66 34.74±6.16 0.83±0.35（n＝48）治疗后66.76±10.55 35.61±5.40*30.81±5.64 1.16±0.32*

2.4 两组治疗前后血清细胞因子水平比较 见表3。两组治疗后IL-17、IL-10水平较治疗前均显著下降（P＜0.01）；与对照组治疗后比较，治疗组治疗后IL-17、IL-10水平明显降低（P＜0.05）。

表3 两组治疗前后IL-17及IL-10水平比较（pg/mL，±s）

表3 两组治疗前后IL-17及IL-10水平比较（pg/mL，±s）

组 别 IL-17 IL-10治疗组 治疗前 191.65±48.25 83.42±23.73（n＝55） 治疗后 118.94±121.66**△ 47.81±14.65**△对照组 治疗前 198.33±31.61 82.67±22.46（n＝48） 治疗后 137.67±119.75** 58.41±16.20**

3 讨论

HBV感染中HBeAg阴性感染占70％。HBeAg阴性CHB具有较高的向肝硬化、终末期肝病、肝细胞癌发展的倾向［4］，其HBV变异所引起的宿主免疫应答的相应变化，往往使感染后的病情进展趋于复杂［5］。国内外研究证实，HBeAg阴性CHB患者外周血CD4+T淋巴细胞减少，CD8+T淋巴细胞增加，CD4+/CD8+比值下降［6-7］。CD4+淋巴细胞的数量和功能下降，直接导致细胞免疫功能低下，不利于宿主对病毒进一步清除。CD8+淋巴细胞过度活化又会导致严重肝组织破坏。伴随T淋巴细胞亚群失衡，CHB患者也存在细胞因子（如IL-17、IL-10等）的失调。IL-17是一种重要的促炎症细胞因子，主要是由活化的记忆性CD4+T淋巴细胞分泌，它可以促进机体局部产生趋化因子，诱导其致炎因子引起组织损害。研究发现IL-17与HBV感染后的肝脏炎性损伤有着密切关系，大部分CHB患者IL-17水平与ALT和病毒载量呈正相关［8］。IL-10是一种强有力的免疫和炎症抑制因子，它可以抑制Th1型免疫应答，降低CHB患者的细胞免疫功能，促进Treg的增殖和活化，导致HBV持续存在［9］。Arnaud等研究表明CHB患者IL-10水平明显升高，高水平的IL-10不利于HBV的清除［10］。如何最大程度改善CHB患者感染后免疫耐受状态，恢复T淋巴细胞亚群的平衡，改善细胞因子的失调，彻底清除HBV，是治疗HBeAg阴性CHB的关键。

恩替卡韦是目前治疗HBeAg阴性CHB抗病毒极有前景的药物，能强效抗病毒，且耐药率低。中医药对HBV的直接作用不及现在的西药抗病毒药物，但中医药能有效改善CHB患者的宿主状态，增强西药抗病毒效果，阻止或延缓CHB病程进一步发展［11］。地五养肝方通过补肾来纠正CHB患者紊乱的免疫功能状态，促进病毒的清除及肝细胞的正常再生，方中重用熟地黄补肾填精扶正，茵陈蒿清热利湿祛邪，共为君药；五味子配熟地黄增强补肾功能，生甘草配茵陈蒿增强清热解毒功能，共为臣药；姜黄辛温通络、活血化瘀为佐药；方中甘草又能调和诸药，行使药之能。全方共奏补肾祛邪之功。临床研究表明地五养肝方能改善HBeAg阴性CHB患者临床证候、抗肝损伤、抗肝纤维化。方中熟地及五味子并入肝肾二经，肝肾同养，对免疫系统具有双向调节作用，使机体免疫抑制状态有一定恢复［12-13］。

本研究结果说明恩替卡韦抗病毒疗效明显，且可间接改善机体细胞免疫功能，与报道一致［14-15］。地五养肝方能改善HBeAg阴性CHB患者的免疫状态，提高恩替卡韦的疗效。

综上所述，T淋巴细胞及各种细胞因子在HBeAg阴性CHB的发病及转归中起到非常重要的作用，地五养肝方与恩替卡韦联用有一定的协同作用，能更好调整细胞因子水平，调节T淋巴细胞亚群的平衡，明显改善肝功能，显著提高HBV DNA转阴率，提高CHB抗病毒疗效。但由于本研究纳入病例少，观察时间短，对地五养肝方联合恩替卡韦疗程及远期疗效，以及地五养肝方调节T淋巴细胞亚群及细胞因子平衡的进一步机制等，还有待进一步研究。

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Effects of Diwu Yanggan Decoction on T lymphocyte Subsets and Cytokines in Peripheral Blood in Pa-tients with HBeAg-negative Chronic Hepatitis B

LUO Junhua，CAO Qiushi. Wuhan General Hospital of PLA Guang-zhou Military Command，Wuhan 430070，China

Objective：To investigate the effects of Diwu Yanggan decoction on T lymphocyte subsets and cytokines in peripheral blood in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B.Methods：103 cases with HBeAg-negative CHB were randomly divided into 2 groups.The control group was only given entecavir 0.5 mg/d while the treatment group was added with Diwu Yangganfang on the basis of entecavir.The treatment course was 48 weeks.The variations of HBV DNA，IL-17，IL-10，CD3+，CD4+and CD8+T lymphocytes in the patients were detected.Results：After 48 weeks treatment，Compared with the control group，the negative conversation rate of HBV DNA was significantly higher in the treatment group（P＜0.05）.The percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes in the treatment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.The levels of IL-17 and IL-10 in the treatment group were significantly lower than those in the control group（P＜0.05）. Conclusion：T lymphocyte and cytokines play extremely important role in the onset and transformation of HBeAg-negative chronic hepatitis B.Diwu Yanggan decoction combined with entecavir can significantly increase the percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes and reduce the levels of IL-17 and IL-10 to improve efficacy.

Diwu Yanggan decoction；Chronic hepatitis B；HBeAg；T lymphocyte subsets；Cytokines

R512.6+2

A

1004-745X（2014）08-1505-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.045

2014-04-04）

国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（JDZX2012052）