苦参碱对HT29人结肠癌细胞凋亡及Bax和BcL-2蛋白表达的影响*

常 城 胡晓岚

（湖北理工学院附属黄石市中心医院，湖北 黄石 435000）

苦参碱对HT29人结肠癌细胞凋亡及Bax和BcL-2蛋白表达的影响*

常 城 胡晓岚△

（湖北理工学院附属黄石市中心医院，湖北 黄石 435000）

目的研究苦参碱对人结肠癌HT29细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。方法取HT29人结肠癌细胞体外培养，加苦参碱处理24～48 h。采用MTT法检测细胞增殖，使用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，采用Western Blot法检测 Bax和Bcl-2蛋白表达。结果在2～16 mg/mL苦参碱作用下，HT29细胞增殖被明显抑制，且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05或P＜0.01）；给予4、8和16 mg/mL苦参碱作用HT29细胞24 h后，细胞凋亡率分别为（14.84±2.35）％、（37.80±2.49）％和（54.10±1.60）％，均明显高于对照组（4.36± 0.23）％（P＜0.05）；经苦参碱作用24 h后，细胞Bax蛋白表达增加，而BcL-2表达减少，呈剂量依赖性。结论苦参碱能抑制HT29细胞增殖，并促进其凋亡，其机制可能与抑制BcL-2和促进Bax蛋白表达有关。

HT29细胞 凋亡 苦参碱 Bax Bcl-2

苦参碱（matrine）系豆科槐属植物苦参的主要有效成分之一，其分子式为C15H24N2O。有实验研究表明，苦参碱对肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌和白血病等多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用［1-5］，但其能否抑制结肠癌细胞的生长，目前尚无文献报道。本实验观察苦参碱对人结肠癌HT29细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人结肠癌HT29细胞由武汉大学中南医院肿瘤实验中心提供。苦参碱购自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和碘化丙锭（PI）为上海华臣生物试剂有限公司产品；胎牛血清购自杭州四季青公司；RPM1640培养基购自杭州微生物试剂公司；蛋白酶K（Proteinase K）、抗Bcl-2和抗Bax鼠抗人单克隆抗体购自武汉博士德公司。

1.2 实验方法 细胞增殖抑制实验：取人结肠癌HT29细胞，复苏后加10％灭活胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的RPMI 1640培养液，置于37℃的5％CO2加湿细胞培养箱内培养［6］。取对数生长期的细胞，在0.25％胰酶消化后，用培养液吹打成单细胞悬液。将细胞密度调整为1×105/mL。以每孔200 μL接种于96孔细胞培养板，分别加入不同质量浓度的苦参碱，终质量浓度分别为2、4、8、16和32 mg/mL，每组各设3个复孔。37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中分别培养24、36和48 h，弃去培养液，代之以无血清RPMI 1640培养液0.2 mL/孔，加入MTT 20 μL/孔（终质量浓度为0.5 mg/mL），置于CO2培养箱中继续培养4 h，吸去上清，加入DMSO 150 μL/孔，在酶标仪570 nm波长处读取OD值，计算细胞增殖抑制率。每组实验至少重复3次［7-8］。细胞形态超微观察：取对数生长期HT29细胞，弃培养液，PBS洗涤2次。加0.25％胰酶消化细胞，调整细胞密度，将细胞按1×106个接种于6孔培养板。加入终质量浓度为8 mg/mL的苦参碱，培养24 h。将胰酶消化收集的细胞置于琼脂离心管中，以1 mL 2.5％戊二醛和1％锇酸固定，纯环氧树脂包埋，按常规电镜样本制作程序处理，铅-铀双染色，在透射电镜（JEM-2010HR型，日本电子株式会社）下观察。细胞凋亡检测：应用不同质量浓度的苦参碱处理HT29细胞24 h，用冷PBS缓冲液冲洗2次，重悬于Binding Buffer中。调整细胞密度至1×106/mL，取100 μL重悬后的细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。随即上流式细胞仪（FACScan，美国BD公司）检测，分析细胞凋亡的百分比。凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的检测：用Western Blot法，取 HT29细胞，经 MA（4 mg/mL、8 mg/mL和16 mg/mL）处理24 h，消化收集细胞，加入细胞裂解液（20mmoL/mLTris-HCl，pH7.4；150mmoL/mL NaCl，0.5％NP-40，1 mmoL/mL EDTA，50 μg/mL亮肽素，1 mmoL/mL PMSF）100 μL，于4℃12000 r/min离心10 min。等量样品（30 μg/mL）经12.5％SDS–PAGE胶分离蛋白质，将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。加入一抗过夜，再加入二抗。洗膜后，加入ECL化学显影剂，X光片曝光。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对HT29细胞生长的抑制作用 见表1。不同质量浓度的苦参碱在24、36、48 h时对HT29细胞都有抑制作用。

2.2 细胞凋亡的形态学变化 见图1。对照组细胞形态正常，细胞膜结构完整，染色质丰富，可见多个核仁；MA处理组细胞出现染色质浓缩、凝固，染色质边集，核固缩。

2.3 细胞凋亡率的变化 经MA作用24 h后，对照组细胞凋亡率为（4.36±0.23）％，3个实验组（4 mg/mL、8 mg/mL和16 mg/mL）细胞凋亡率分别为（14.84± 2.35）％、（37.80±2.49）％和（54.10±1.60）％，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 不同质量浓度苦参碱对HT29细胞的生长抑制作用（±s）

表1 不同质量浓度苦参碱对HT29细胞的生长抑制作用（±s）

与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组 别 24 h 36 h 48 h对照组 0.0±0.1 0.0±0.1 0.0±0.1苦参碱2 mg/mL组 9.2±0.7△ 22.1±0.2△ 29.7±1.3△苦参碱4 mg/mL组 17.9±3.5△ 42.5±2.8△ 54.2±1.9△苦参碱8 mg/mL组 45.9±3.9△△ 58.2±4.3△△ 68.3±4.8△△苦参碱16mg/mL组 59.4±3.4△△ 68.3±4.8△△ 75.8±0.9△△苦参碱32 mg/mL组 71.6±0.8△△ 77.1±2.3△△ 84.2±1.5△△

图1 8 mg/mL苦参碱作用细胞24 h后细胞形态变化（5000倍）

2.4 苦参碱对Bax和Bcl-2表达的影响 见图2。苦参碱能够显著降低细胞内Bcl-2表达，并增加细胞内Bax表达，呈剂量依赖性。

图2 苦参碱作用HT29细胞24 h后Bax和Bcl-2蛋白表达的变化

3 讨论

苦参碱具有较强的抗肿瘤活性，能够抑制多种肿瘤细胞的生长［9-12］。本研究观察到随着药物质量浓度的增高和作用时间的延长，肿瘤细胞增殖受到明显抑制。同时还发现苦参碱能诱导结肠癌细胞凋亡，随着药物质量浓度的增加，细胞凋亡率明显增加，呈剂量依赖性。本实验以8 mg/mL苦参碱作用HT29细胞24 h后，发现细胞核体积缩小，染色质浓缩凝固，染色质边聚、核固缩、核碎裂及凋亡小体出现，进一步证实了苦参碱诱导结肠癌HT29细胞凋亡的作用。笔者还观察到苦参碱对凋亡相关调节蛋白Bax和Bcl-2表达有影响，苦参碱能够显著降低细胞内Bcl-2表达，增加细胞内Bax表达，呈剂量依赖性。由此笔者推测苦参碱通过增加促凋亡蛋白 Bax的表达和减少抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达来发挥抗肿瘤作用。

苦参碱在体外可直接抑制或杀伤人结肠癌HT29细胞，具有较强的增殖抑制及诱导凋亡能力，是一种有应用前景的抗肿瘤药物。

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Effect of Matrine on Apoptosis of HT29 Cells and Inhibition of Bcl-2/Bax Expression in Vitro

CHANG Cheng，HU Xiaolan. Huangshi Central Hospital of Hubei Polytechnic University，Hubei，Huangshi 435000，China

Objective：To study the effect of matrine（MA）on apoptosis and Bcl-2/Bax expression in HT29 cells（human colon cancer cells）.Methods：HT29 cells cultured in vitro were subjected to MA at concentration of 2～32 mg/mL for 24 h or 48 h.Cell proliferation and apoptosis were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively，and the expression of Bcl-2 and Bax was detected by Western blot.Results：MA（2～16 mg/mL）significantly inhibited the proliferation of HT29 cells in a dose-and time-dependent manner（P＜0.05）.After intervention of MA at 4，8 or 16 mg/mL for 24h，the percentage of apoptotic cells was increased to （14.84±2.35）％，（37.80±2.49）％and （54.10±1.60）％，respectively，all of which were significantly higher than （4.36±0.23）％in the control group（P＜0.05）.MA（at 4～16 mg/mL）significantly increased the expression of Bax and decreased the expression of Bcl-2 in a dose-depended manner.Conclusion：MA inhibits proliferation and induces apoptosis of HT29 cells in vitro，probably through down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax.

HT29 cell lines；Apoptosis；Matrine；Bax；Bcl-2

R730.59

A

1004-745X（2014）08-1463-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.026

2014-04-03）

湖北省自然科学基金资助（2013CFC061）

△通信作者