3种常见脂多糖所致急性肺损伤大鼠模型肺损伤程度相关性研究*

申友奎 杨 勇 董礼文 王 军 傅晓青

（浙江省杭州市中医院，浙江 杭州 310007）

3种常见脂多糖所致急性肺损伤大鼠模型肺损伤程度相关性研究*

申友奎 杨 勇 董礼文 王 军 傅晓青

（浙江省杭州市中医院，浙江 杭州 310007）

目的研究3种常见脂多糖所致急性肺损伤（ALI）大鼠模型，并探讨模型制作的方法和经验。方法选择130只健康SD大鼠，随机分4组，尾静脉注射组（40只）采用尾静脉注射造模，气管注入模型组（40只）采用气管注入造模，二次打击模型组（40只）采用“二次打击”方式造模，另选10只SD大鼠为对照组。结果完成实验后，尾静脉注射组死亡4只，气管注入模型组死亡10只，二次打击模型组死亡12只，尾静脉注射组与气管注入模型组、二次打击模型死亡率组比较具有明显差异。肺组织干湿质量比3组之间无显著性差异；病理学显示气管注入模型组病理损伤不均匀，以气道上皮的水肿、坏死脱落，气道内以中性粒细胞为主的多种炎细胞浸润为主要特点。尾静脉注射组及二次打击模型组病理损伤多较均匀，以毛细血管渗透性增高，纤维蛋白渗出，肺水肿形成为主要特点。尾静脉注射组较气管注入模型组量化值稍高，但未见明显统计学差异，尾静脉注射组、气管注入模型组与二次打击模型组量化值比较，量化值增高明显，具有显著差异（P＜0.05或0.01）。结论3种方式均能成功制造急性肺损伤模型，但尾静脉注射组死亡率低，操作简便且病理学较为符合人类ALI病理学改变，且稳定可靠。

急性肺损伤脂多糖模型

急性肺损伤（ALI）的相关性研究已经持续了很多年，然而其死亡率仍然居高不下，建立完善的动物模型是阐明其发病机制的前提和重要保证。理想的ALI模型应可模拟人类ALI发病机制和发生、发展过程，但目前尚无一种动物模型能完全模拟人类ALI病变特征。笔者采用目前常用的3种脂多糖所致ALI大鼠模型进行比较，为下一步研究提供切实依据。

1 材料与方法

1.1 药物脂多糖（LPS）产自Sigma公司，批号为0111：B4。

1.2 动物健康SD大鼠，SPF级，雌雄不限，体质量250～300g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.3 分组与造模将120只SD大鼠随机分为尾静脉注射组、气管注入模型组、二次打击模型组、每组40只。再选择10只SD大鼠作为对照组。实验前禁食12h，自由饮水。（1）尾静脉注射组。尾静脉注射LPS，剂量为4mg/kg，4 h后，观察大鼠死亡率、呼吸频率，处死大鼠，摘取肺组织，用于病理学检查机测定含水量。（2）气管注入模型组。应用水合氯醛30mg/kg腹腔内注射麻醉，仰卧固定于鼠板上，消毒后逐层分离暴露气管，沿气管切T型切口插Y型管，建立外部呼吸通道，并用注射器分别经支气管缓慢滴注事先用生理盐水配制的LPS（2mg/mL）溶液，待大鼠呼吸状态稳定后，缝合伤口后放回鼠笼。8 h后，观察大鼠死亡率、呼吸频率，处死大鼠采取肺组织，用于病理学检查及含水量测定。（3）二次打击模型组。应用水合氯醛30mg/kg腹腔内注射麻醉，仰卧固定于鼠板上，在大鼠腹腔注射麻醉后钳夹双侧股骨中段闭合骨折，2 h后腹腔注射LPS（16mg/kg）。24 h后，观察大鼠死亡率、呼吸频率，处死大鼠采集肺组织，用于病理学检查及含水量测定。

1.4 肺组织含水量测定取部分左肺，滤纸吸干表面水分，置于干燥称量纸上称得湿质量（W），置70℃恒温箱，烘烤至恒重后称量干质量（D），以湿质量/干质量（W/D）比值表示肺组织含水量。

1.5 肺脏组织学观察取剩余左肺放入10％甲醛溶液固定，常规脱水、包埋、苏木素伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理改变。将肺组织学改变程度分为“无”、“轻”、“中”和“重”4级进行比较，并量化成计量单位。比较内容包括毛细血管充血、肺泡腔纤维蛋白渗出、肺泡腔及其间隔中性粒细胞渗出、气道黏膜上皮细胞脱落、肺泡间隔增宽，见表1。

1.6 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。数据以（±s）表示，两组之间比较用t检验。P＜0.05为差异有显著统计学意义，P＜0.01为差异有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡率、呼吸频率比较（1）死亡率比较：尾静脉注射组死亡4只，均在3 h后死亡，死亡率10.00％，气管注入模型组死亡10只，1 h内死亡5只，2 h内死亡3只，6～8 h死亡2只，死亡率25.00％，二次打击模型组死亡12只，1 h内死亡2只，4～8 h死亡2只，8～10 h死亡8只，死亡率30.00％。（2）呼吸频率比较：见表2。

表1 肺组织学观察程度

2.2 肺组织含水量测定见表2。

表2 各组呼吸频率及肺组织含水量比较（±s）

表2 各组呼吸频率及肺组织含水量比较（±s）

与对照组比较，△P＜0.05。

组别n呼吸频率（次/min）W/D尾静脉注射组36 108.44±9.58△4.32±0.21△气管注入模型组30 110.53±7.10△4.33±0.20△二次打击模型组28 104.25±4.18△4.27±0.16△对照组10 71.50±5.00△3.99±0.21

2.3 病理学观察从病理照片（图1）可以看出对照组肺组织结构明显，毛细血管充血，肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡间隔无水肿，3个模型组均有大量炎性细胞浸润，透明带与肺泡结构破坏，毛细血管充血，上皮细胞脱落。但气管注入模型组病理损伤不均匀，气道上皮的水肿、坏死脱落，气道内以中性粒细胞为主的多种炎细胞浸润为主要特点。尾静脉注射组及二次打击模型组病理损伤多较均匀，以毛细血管渗透性增高、纤维蛋白渗出、肺水肿形成为主要特点。从表3可以看出尾静脉注射组较气管注入模型组量化值稍高，但未见明显统计学差异，尾静脉注射组与二次打击模型组具有极显著性统计学差异（P＜0.01），气管注入模型组与二次打击模型组比较，量化值增高明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 大鼠肺组织病理学改变（HE，200倍）

表3 肺组织学改变程度量化值（±s）

表3 肺组织学改变程度量化值（±s）

组别n病理学量化值尾静脉注射组36 11.89±1.97气管注入模型组30 11.63±2.06二次打击模型组28 10.61±2.00*△与尾静脉注射组比较，*P＜0.01；与气管注入模型组比较，△P＜0.05。

3 讨论

通过实验研究，诱导建立可靠理想的ALI模型，是对人类ALI的发病机制和诊疗策略的研究的重要保障。目前建立此模型的方法主要有3种［1］：（1）物理方法，主要以创伤为主；（2）化学方法，油酸、脂肪型、整肺灌洗型、白枯草型等；（3）生物方法，内毒素型、休克复合内毒素型、急性胰腺炎型、肿瘤坏死因子型等。其中内毒素致ALI模型是急性肺损伤模型中较为经典成熟的模型。尾静脉注射、二次打击及支气管滴注是目前内毒素复制大鼠ALI模型的常用的给药途径。

本实验重复了3种常用的给药途径诱导急性肺损伤的造模方式，3组实验动物的呼吸频率均有明显增快，与人类ALI的临床较为吻合。尾静脉注射组死亡率较低，死亡发生在造模晚期，气管注入组死亡率较高，且死亡多出现在造模早期，可能与操作复杂、药物浓度高，且打击较为直接有关。二次打击死亡率较高，死亡多出现在造模晚期，可能与第一次打击激发引起机体全身炎症反应综合征，此时由于大量炎性因子的释放和机体免疫功能降低，使机体敏感性增高，在此基础上第二次打击造成炎症失控引起实验大鼠死亡有关。

病理观察结果显示，3组均有大量炎性细胞浸润、透明带与肺泡结构破坏、毛细血管充血、上皮细胞脱落；气管注入组病理的表现病理损伤不均匀，且气道上皮的水肿、坏死脱落，气道内以中性粒细胞为主的多种炎细胞浸润更为明显，造成的原因可能与造模过程中气管内注入的LPS分布不均相关。尾静脉注射组及二次打击组病理损伤多较均匀，以毛细血管渗透性增高、纤维蛋白渗出、肺水肿形成为主要特点，可能与LPS先进入血液循环，再导致全身性脓毒血症有关的［2］。

从3种操作方式而言，尾静脉注射组最为简便，二次打击组操作较复杂，支气管注入组操作更为复杂，且对实验者的要求比较严格。总之，3种实验模型均能成功复制ALI模型，可用来研究ALI的发生、发展过程及相关的问题的研究，是良好有效的实验动物模型，但尾静脉注射组死亡率低、操作简便且病理学较为符合人类ALI病理学改变。

［1］李竹英，王雪慧，刘建秋.急性肺损伤动物模型研究进展［J］.中国中医急症，2011，20（11）：817-1818.

［2］朱耀斌，李晓锋，张燕搏，等.急性肺损伤动物模型［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2011，25（7）：625-628.

Correlation Study of 3 Acute Lung Injury Rats Models induced by Lipopolysaccharides

SHEN You-kui，

YANG Yong，DONG Li-wen，et al.TCMHospital of Hangzhou City，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310007，China

Objective:To study 3 widely used rats models of acute lung injury by lipopolysaccharides and to discuss the modelmaking methods and experiences.Methods:130 healthy SD rats were divided into 4 groups random ly including the tail vein injection group with 40 rats，the trachea injection group with 40 rats，the secondary blow mold group with 40 rats and the control group with 10 rats.Results:After being finished the experiment.There were some rats died such as 4 rats in the tail vein injection group，10 rats in the trachea injection group，12 rats in the secondary blow mold group.Compared with the trachea injection group and the secondary blow mold，the tail vein injection group had significant differences in themortality.There were no significant differences among 3 groups in wet and dry lung tissuemass ratio.3 groups of pathology showed that the trachea injection group pathological damage was uneven.Meanwhile，the airway epithelial edema and the necrosis felloff. The airway predominantly neutrophils were a variety of inflammatory cell infiltration as the main characteristics. The tail vein injection group and the secondary blowmold group pathological damage weremore uniform，capillary permeability increase，fibrin exudation and edema formation as the main characteristics.quantitative value of pathological in tail vein injection group was a bit higher than that in the trachea injection group.However，there were no significant differences among these indicators.The tail vein injection group and the trachea injection group compared with the secondary blow mold group quantitative values of pathological increased obviously，there was the extremely significant difference in them.Conclusion:3 methods can successfully manufacture model of acute lung injury.Themortality rate is low，easy to operate and pathologicalmore accord with human ALI pathological change in the tail vein injection group.Themodel is stable and reliable.It is the further study basis of acute lung injury occurrence，development process and related problems.

Acute lung injury；Lipopolysaccharide；Model

浙江省自然科学基金资助项目（Y2111294）

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0019-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.009

2013-09-12）

·病例报告·