舒郁散对慢性应激抑郁大鼠行为及海马糖皮质激素受体表达的影响*

陈利平 王发渭 段冬梅 孙志高 许成勇

（解放军总医院海南分院中医科，海南 三亚 572004）

·研究报告·

舒郁散对慢性应激抑郁大鼠行为及海马糖皮质激素受体表达的影响*

陈利平 王发渭 段冬梅 孙志高 许成勇

（解放军总医院海南分院中医科，海南 三亚 572004）

目的观察舒郁散对慢性不可预见性应激（CUMS）抑郁大鼠的行为变化及对大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量、海马内糖皮质激素受体表达的影响。方法50只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、百忧解组、舒郁散小剂量组、舒郁散大剂量组。对大鼠进行21 d的CUMS刺激，采用糖水实验、悬尾实验观察大鼠的行为改变，用ELISA法测大鼠脑组织TNF-α含量，免疫组化观察大鼠海马GR表达。结果百忧解组、舒郁散大剂量组大鼠的尾悬不动时间明显延长、糖水消耗百分率明显下降，与模型组比差异显著（P＜ 0.01）。百忧解、舒郁散大剂量治疗组大鼠悬尾不动时间明显减少，糖水消耗量明显增加，与模型组比差异显著（P＜0.05）。百忧解、舒郁散大剂量治疗组大鼠脑组织TNF-α含量显著降低，与模型组比差异显著（P＜ 0.05）。模型组海马GR免疫反应阳性神经元数目明显减少，百忧解组、舒郁散大剂量组海马GR免疫反应阳性神经元数目明显增加，平均光密度明显增强，与模型组比差异显著（P＜0.05）。结论动物行为学显示舒郁散具有抗抑郁作用，这种作用与降低CUMS抑郁大鼠脑组织TNF-α含量，增强海马糖皮质激素受体表达有关，上述作用与其剂量呈正相关。

舒郁散抑郁大鼠动物行为糖皮质激素受体海马肿瘤坏死因子-α

抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合征，其病因和发病机制尚未完全阐明，研究表明与心理、神经递质、内分泌、激素水平的变化有关［1］。机体长期处于应激状态时，会出现神经、内分泌的功能改变，主要变化为下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的功能亢进，出现大脑海马区激素受体的表达过度引起海马神经元的损伤及其功能障碍［2］，患者出现情绪低落、抑郁、失眠、健忘等症状［3］。舒郁散是本院临床应用多年治疗抑郁症的有效验方，具有疏肝解郁、养心安神之功效，可改善抑郁患者的临床症状；可调节慢性应激抑郁大鼠血清激素水平、神经递质、神经肽以及海马5-HT受体表达而发挥抗抑郁的作用［4-5］。本研究采用慢性不可预见的应激（CUMS）抑郁模型，观察舒郁散对模型大鼠行为、海马肾上腺皮质激素受体表达的影响，为临床治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 动物及分组50只Wistar大鼠，解放军总医院医学实验动物中心提供，动物号为SCXK-京-2011-0005，体质量180～220g。随机分为正常对照组、模型组、百忧解组（20mg/次）、舒郁散小剂量组（含生药0.5 g/mL）、舒郁散大剂量组（含生药5.0 g/mL），每组10只大鼠。正常对照组每笼饲养5只，其他组每笼饲养1只。

1.2 试物与仪器舒郁散由枣仁、郁金、栀子、五味子、炙麻黄组成，浓缩成含生药量5 g/mL药液，存冰箱备用，使用时蒸馏水稀释灌胃；百忧解胶囊，礼来苏州制药有限公司分装，批准文号：国药准字2006017。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）放免试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所生产；GR多克隆抗体（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号：SP-9000），二抗试剂盒：EnVision Detection Kit基因科技（上海）有限公司产品（Code No.GK500705）。全自动真空脱水机（LEICAASP300）、组织包埋机（LEICA EG1140H）、石蜡切片机（LEICA RM2135）、展片机（LEICA HI1210，德国LEICA公司）；光学显微镜（日本OLYMPUSBX60系统显微镜），酶标仪THERMOMultiskanMK3（美国产品）。

1.3 模型制备对大鼠进行21 d应激刺激，包括：摇晃5min，禁水24 h、禁食24 h、夹尾1min，电击足底（每次10 s，间隔1min），冰水游泳5min，噪音刺激、转换昼夜节律24 h，制动，热刺激40℃5min。连续造模和给药21 d，每日上午给药，下午给予相应刺激［6］，以制备CUMS抑郁模型。

1.4 动物行为学检测

1.4.1 悬尾实验（TST）将大鼠尾端4 cm的部位固定在一根水平木棍上，使之呈倒挂状态，其头部离水平面5～6 cm，用木板隔开相邻大鼠的视线，记录每只动物在5min内不动时间；实验后用酒精清除箱内上一只大鼠留下的残留物和气味，防止对其他大鼠行为产生影响。

1.4.2 糖水消耗实验（SPT）实验前给大鼠正常的水和食物供应，实验开始时移去所有食物和水，将大鼠单独成笼，每个笼子中央紧靠着放体积相同的1％蔗糖水和自来水各1杯，在5 h内让其自由摄水。为了防止大鼠对某侧的蔗糖水或自来水形成特殊的偏好，5 h后，交换蔗糖水和自来水的位置。再经过5 h后，测量大鼠摄入蔗糖水和自来水的量，计算出摄入蔗糖水的百分比=蔗糖水量/（蔗糖水量+自来水量）×100％。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 脑组织TNF-α含量测定行为实验结束后处死大鼠，断头取脑，分离大脑皮层，生理盐水冲洗，称质量，制备成10％组织匀浆，-70℃冰箱中保存测脑组织TNF-α含量。

1.5.2 海马GR免疫组化检测参照大鼠脑定位图谱［7］，取海马进行脱水、包埋，置于APES防脱玻片上。烤片、脱蜡、脱水、浸洗；3％H2O210min，PBS浸洗2min，共3次；浸入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液。微波热修复后，滴加一抗NPY多克隆抗体（1∶200），4℃冰箱孵育过夜，室温复温30min后PBS浸洗5min，共3次后滴加非生物素二抗，湿盒中室温30min，PBS浸洗5min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，脱水、透明、封片。采用Image Pro plus5.1图像分析系统对阳性细胞灰度进行图像分析，取平均值行统计学处理。

1.6 统计学处理应用SPSS12.0统计软件。所有数据以（±s）表示。数据进行正态性检验，多个样本均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗后各组TST、SPT的比较见表1。结果显示模型大鼠悬尾实验中不动时间明显增多，糖水消耗百分率明显下降，与正常对照组比差异显著（P＜0.01），说明造模成功。百忧解组、舒郁散大剂量组大鼠悬尾不动时间明显减少，糖水消耗百分率显著升高，与模型组比差异显著（P＜0.05）。

表1 各组TST、SPT结果比较（分，±s）

表1 各组TST、SPT结果比较（分，±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别n悬尾不动时间（s）糖水消耗百分比（％）正常对照组10 56.00±5.24 86.42±11.25模型组10 84.40±7.74*51.43±8.76*百忧解组10 66.72±6.23△77.24±10.26△舒郁散大剂量组10 68.24±6.46△75.36±9.74△舒郁散小剂量组10 78.46±7.25 67.25±9.14

2.2 治疗后各组大鼠脑组织TNF-α含量、海马GR表达见表2。结果显示模型组大鼠脑组织TNF-α含量明显升高，与对照组比差异显著（P＜0.05）；大剂量舒郁散、百忧解治疗后脑组织TNF-α含量显著降低，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。光镜下可见GR免疫反应阳性细胞的胞核呈棕黄色，多位于细胞核内，胞浆免疫染色浅。模型组大鼠海马区GR阳性细胞数目减少，表达减低，平均光密度值明显减弱与正常对照组比差异显著（P＜0.05）；百忧解及舒郁散大剂量治疗后大鼠海马区GR表达明显增加，平均光密度明显增多，与模型组比差异显著（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织TNF-α含量、海马GR表达比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织TNF-α含量、海马GR表达比较（±s）

组别n正常对照组10模型组10百忧解组10舒郁散大剂量组10舒郁散小剂量组10脑组织TNF-α（pg/mL）海马GR积分平均光密度值20.46±1.85 0.134±0.013 38.42±5.76*0.376±0.034* 23.84±4.63△0.245±0.026*△24.15±4.72△0.253±0.028*△29.67±5.14 0.298±0.032

3 讨论

HPA轴是抑郁症的主要作用激素系统，50％以上的抑郁症患者存在HPA轴的功能紊乱，抑郁症患者存在与应激密切相关的HPA轴过度激活现象，表现为血浆皮质醇、促肾上腺皮质激素及促肾上腺皮质激素释放激素的增高［8］。海马还具有调节情绪、记忆、学习等功能，是慢性应激反应的主要受影响中枢和调节中枢。海马中皮质醇受体的含量最高，因此海马主要涉及HPA轴的负反馈机制，通过GR抑制应激过程中亢进的HPA轴的功能。长期的慢性应激会导致HPA轴的功能亢进，机体分泌的皮质醇增多，过量的皮质醇及应激可引起神经元处于易损状态，出现海马神经元的凋亡，易于发生应激损伤性疾病如抑郁症等。在动物实验中，长期用抗抑郁药能提高大鼠脑中的GR和盐皮质激素受体的水平，降低应激反应介导的糖皮质激素过多的分泌［9］。

本研究通过采用CUMS抑郁模型［10］，不仅可模拟抑郁症的核心症状，即兴趣丧失，快感缺乏，运动能力、探索行为能力及性行为能力等下降，同时存在HPA轴的亢奋。现在大部分学者采取糖水消耗量和糖水偏爱百分比作为测量快感缺乏的有效指标［11］。本研究显示：CUMS抑郁症大鼠糖水消耗量明显下降，而大剂量舒郁散治疗组其糖水消耗量明显增加，提示给药组大鼠对幸福事件反应能力的增加。尾悬不动时间是大鼠绝望的反应，大剂量舒郁散能明显减少CUMS抑郁症大鼠尾悬不动时间，说明舒郁散具有抗抑郁的作用。舒郁散可以降低CUMS抑郁大鼠脑组织TNF-α含量，减轻应激引起的炎症发生。在大脑中，皮质醇通过与受体结合来影响各种神经递质、神经调质、及其他的受体的合成和功能，以调节大脑神经元的功能［12］，舒郁散能增强海马糖皮质激素受体表达，减少过量皮质醇的产生，减轻应激反应引起海马神经元调亡，保护海马神经元。

抑郁症类似于中医的“郁证”，其发病大多是由情志所伤，肝失疏泄，肝气郁结，气机不和所致，病变部位初期在肝，随着肝郁气滞、气机失和，日久则伤及心、脾二脏，或为心火，或肝郁犯脾。因此，治疗抑郁症，实证以疏肝理气解郁为主，虚证宜养心健脾安神。舒郁散具有调理心肝、疏肝理气、养心解郁之功效，对抑郁症的治疗具有较好疗效，对慢CUMS抑郁血清的肾上腺皮质激素水平具有调节作用［13-14］。本实验结果显示大剂量舒郁散能明显增加CUMS大鼠糖水消耗量、减少CUMS大鼠尾悬不动时间，具这种作用与降低CUMS大鼠脑组织TNF-α含量，增强海马糖皮质激素受体表达有关，这可能是其抗抑郁的作用机制之一。

本研究仅观察舒郁散对CUMS抑郁大鼠行为、脑组织TNF-α含量，海马糖皮质激素受体表达的变化，抑郁症的发病机理较为复杂，有关舒郁散的作用机理还有待与进一步的研究。

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Effect of Suyusan on the Behavior and Glucocorticoid Receptor Expression in Hippocampuswith Chronic Unpredictable Mild Stress induced Depression Rats

CHEN Li-ping，WANG Fa-wei，DUAN Dong-mei，et al.

Hainan branch of PLA General Hospital，Hainan，Sanya 572004，China

Objective：To investigate the effect of Suyusan on the behavior，the contents of tumor necrosis facor-α（TNF-α）in cortexand glucocorticoid receptor expression in hippocampuswith chronicmild unpredictable tressmodel of rats（CUMS）.Methods：50 Sprague-Dawley ratswere random ly divided into 5 groups：Normalcontrol group，CUMSmodel group，CUMS group plus fluoxetine treatment group，and CUMS group plus high/low dose Suyusan treatment group.Except normal group，the other groups were given the chronic mild unpredicted timulated for 21 days.Aftermodeling，the behavior of the rats was detected by Tail suspend test（TST）and sucrose preference test（SPT）.The contentof TNF-αin cortex was determined by enzyme linked immunosorbentasay（ELISA）.The immunocytochemical technique was used to evaluate hippocampus GR immunoreactive express.Results：The fluoxetinetreatmentgroupand highdose of Suyusan group showed significant increase in the sucrose consumption and decrease in the immobility time in TST，there was a significant difference compare with CMUS-model group.The TNF-αlevel was significantly lower in fluoxetine group and high dose of Suyusan group，there was significant difference compare withmodel group（P＜0.05）.The GR immunoreactive neurons in hippocampus areawas increased by amarked number in fluoxetinegroup and Suyusan high dose group，the average optical denity increased significantly，compared with themodel group，there were significant differences（P＜0.05）.Concluion：Suyusan has anti-depressionlikely effect.this effect connected with decrease TNF-αlevels in cortex of cerebraland increase expression of GR in hippocampuswith CMUS rats.

Suyusan；Depression；Rats；Behavior；Glucocorticoid receptor；Hippocampus；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0014-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.007

军队“十二五”科研攻关项目（CWS12J129）

2013-09-25）

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