粒细胞集落刺激因子对失代偿期肝硬化患者骨髓干细胞的动员效果及安全性观察

王迪 郭晓钟 李宏宇 崔忠敏 任丽楠 赵佳钧 邵晓冬 吴春燕

粒细胞集落刺激因子对失代偿期肝硬化患者骨髓干细胞的动员效果及安全性观察

王迪 郭晓钟 李宏宇 崔忠敏 任丽楠 赵佳钧 邵晓冬 吴春燕

目的观察失代偿期肝硬化患者行自体骨髓干细胞移植前粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对骨髓干细胞的动员效果及安全性。方法在51例失代偿期肝硬化患者行自体骨髓干细胞经肝动脉移植术前，连续2 d给予G-CSF 4 μg/(kg•d) 动员骨髓干细胞。抽取骨髓的当日化验血常规、肝肾功等指标；从患者髂后上棘抽取骨髓150～200 ml，分离收集骨髓单个核细胞并计数，应用流式细胞仪检测CD34+细胞并计数，观察应用G-CSF期间不良反应的类型和发生率。患者治疗前后比较采用配对t检验进行统计学分析。结果G-CSF皮下注射后，外周血白细胞由术前（3.31±0.96）× 109/L升至（11.35±1.92）× 109/L (P< 0.01)，骨髓单个核细胞数（1.91±0.83）× 109/kg，CD34+细胞为（2.02±1.29）× 107/kg；患者皮下注射后，发热率17.6﹪，体温最高38℃，停药后降至正常；腹部胀痛3例，四肢皮肤散发皮疹2例，均未给予特殊处理，2～3 d后恢复正常。结论给予G-CSF皮下注射后提取骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的是一种临床确切有效的、安全的干细胞动员方法。

肝硬化；粒细胞集落刺激因子；间充质干细胞；干细胞动员；有效性；安全性

失代偿期肝硬化是各种肝纤维化疾病的终末期，表现为肝功能衰竭、门静脉高压及多种并发症，死亡率高，其特征性的病理表现为肝结构紊乱及假肝小叶形成。

自体骨髓干细胞移植治疗各种肝脏疾病是目前临床热点。在干细胞移植治疗前需要骨髓干细胞的动员，动员剂的选择，效果及安全性是决定干细胞治疗成功与否比较重要的步骤，值得关注和探讨[1-3]。

粒细胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）是一种促粒细胞增殖的细胞因子，大量的基础研究表明，G-CSF能够动员骨髓干细胞，使骨髓干细胞与基质细胞的黏附作用被打破，有利于骨髓干细胞的收集与纯化[4-5]。在干细胞治疗失代偿期肝硬化术前，采用皮下注射G-CSF的方法动员骨髓干细胞，临床证明是一种简便、有效的方法。

资料与方法

一、病例选择

选择2007年5月至2008年11月在沈阳军区总医院消化内科住院患者51例，年龄26～71岁，其中女20例，男31例，平均年龄46岁，其中肝炎后肝硬化43例，酒精性肝硬化7例，血吸虫性肝硬化1例，肝功能Child B级24例，Child C级29例。诊断符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，符合2006版《酒精性肝病诊疗指南》诊断标准，术前经影像学检查排除原发性肝癌，3个月内无消化道出血及肝性脑病并发症，1周内无发热、骨痛、头痛等；无新发生的皮疹、皮下瘀斑等；无恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。术前3～7 d常规化验血液分析、凝血功能等指标。手术经过医院伦理委员会批准，所有治疗在患者知情同意情况下进行，签署《知情同意书》。

二、术前准备

术前常规行腹部彩色超声或腹部CT检查，化验血清肿瘤标志物，确诊肝硬化并排除肝脏恶性肿瘤，常规抽取外周血检测白细胞及血小板。骨髓穿刺前给予重组人粒细胞集落刺激因子注射液（rhG-CSF，齐鲁制药有限公司，批号20070422，国药准字S19990049，执行标准6.0×106IU（100 μg）:0.6 ml/支），4 μg/（kg•d），皮下注射，每日1次，连续2 d，期间观察患者有无肌肉酸痛、骨痛、乏力、皮疹、胃肠道反应、脾破裂、严重感染及呼吸困难等临床变化[3，8]。

三、骨髓干细胞采集及外周血常规化验

手术当日常规抽血化验血液分析、凝血功能等。手术当日行骨髓细胞采集，取右侧髂后上棘为穿刺点，局部消毒麻醉，在无菌条件下，以18号骨髓穿刺针穿刺，依据患者体重及拟获得的单核细胞数量，抽取骨髓150～200 ml，以7500 U肝素抗凝，然后采用负筛选法进行骨髓干细胞的体外分离及纯化，获取单个核细胞并计数，采用流式细胞仪检测CD34+干细胞数。

四、统计学分析方法

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，外周血白细胞、血小板、凝血酶原时间、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血清白蛋白以表示，患者治疗前后比较采用配对t检验，以P< 0.01为差异有统计学意义。

结 果

相较于G-CSF动员前，给予G-CSF皮下注射2 d后外周血白细胞由(3.31±0.96）× 109/L升至（11.35±1.92）× 109/L，P< 0.01，血小板由（73.55±24.83）×109/L升至（104.92±42.92）×109/L，P< 0.01，差异有统计学意义；而凝血酶原时间、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆红素及血清白蛋白与G-CSF动员前无明显变化（P> 0.05,表1）。

G-CSF皮下注射2 d后采集的骨髓，经体体外分离纯化，发现单个核细胞计数为（1.913±0.826）× 109/kg，流式细胞仪检测CD34+干细胞数为（2.017±1.285）× 107/kg。

给予G-CSF皮下注射后，有17.6﹪（9/51）患者出现发热，体温最高38℃，停药后降至正常；有6.9﹪（3/51）的患者出现腹部胀痛；有3.9﹪（2/51）的患者出现四肢皮肤散发皮疹，均未给予特殊处理，2～3 d后恢复正常。

表1 51例肝硬化患者G-CSF动员前后外周血及肝功指标变化(± s)

表1 51例肝硬化患者G-CSF动员前后外周血及肝功指标变化(± s)

血清白蛋白(g/L)动员前 3.31±0.96 73.55±24.83 16.43±2.29 104.41±97.68 75.40±51.51 30.55±15.09 32.26±5.23动员后 11.35±1.92 104.92±42.92 17.48±4.40 93.15±55.71 72.36±46.52 31.70±16.44 32.48±5.13t值 27.21 4.28 -1.58 -1.13 -5.43 -1.74 2.01P值 0.00 0.00 0.12 0.08 0.03 0.35 0.54外周血白细胞（×109/L）血小板（×109/L）凝血酶原时间(s)谷丙转氨酶(U/L)谷草转氨酶(U/L)总胆红素(μmol/L)

讨 论

干细胞移植是近年来临床治疗肝硬化的热点，各型慢性肝病患者发展到失代偿期肝硬化时，通过移植具有分化增殖能力的干细胞，使其在肝脏内分化成肝细胞，可以代偿部分肝功能，从而减轻肝硬化的症状和体征。临床应用的干细胞主要来源于骨髓干细胞，骨髓干细胞可以横向分化为肝细胞而没有细胞融合，且能分化成为功能完备的肝细胞。干细胞动员剂能使骨髓干细胞计数增加，因此能提高干细胞移植的疗效，这方面的应用逐渐受到临床的重视。文献报道，干细胞动员剂有多种，如干细胞因子、一些单克隆抗体等，而近年来应用最多的干细胞动员剂是G-CSF[6-7]。

G-CSF是一种大小为19.6 ku的蛋白质，由174个氨基酸组成，其编码基因位于17号染色体q11-22区域，长约23 kb，含5个外显子和4个内含子。G-CSF的生物学效应是通过与效应细胞表面特异受体结合而产生作用的。G-CSF受体（granulocyte colony-stimulating factor receptor,G-CSF-R）是一个膜转运蛋白，由813个氨基酸组成的单一跨膜区的多肽链分子组成[8]。

本研究在采用自体骨髓干细胞治疗肝硬化患者的过程中，以重组人G-CSF作为动员剂，发现动员后外周血白细胞的数量较动员前增长了4.5倍，动员前后两者差异有统计学意义。通过动员骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化，取得了良好的的临床效果[9-10]，也证明了骨髓动员的必要性，而延迟骨髓动员的时间，可能会增加副作用。在临床上，造血干细胞治疗血液病的干细胞动员方面，常规G-CSF用量为2.5～10 μg/（kg•d），应用时间4～7 d。G-CSF具有促进骨髓源干细胞进入细胞周期增殖的作用，而且也存在时间效应，有研究表明骨髓源干细胞增殖的高峰在应用G-CSF 5～6 d，随后即下降。同时，随着G-CSF使用剂量的增加和时间的延长，会导致外周血白细胞异常升高，产生“类白血病”反应，严重者会因大量白细胞阻塞，造成脑梗死、心肌梗死等致命并发症[8-10]。

临床上肝硬化失代偿期患者几乎都伴有肝功能异常、凝血功能障碍及脾功能亢进导致的低白细胞、低血小板的状态，采用常规的G-CSF动员方法，有可能导致肝硬化患者临床症状的加重及化验指标的剧烈波动，并带来致命的并发症如脾破裂、休克等[8-9]。本研究应用G-CSF动员外周血白细胞最高升至17.7×109/L，仅有17.6﹪的患者出现发热，6.9﹪的患者出现轻度腹痛及少量患者出现肢体皮疹，未出现上述所报道的严重的并发症，进一步证实了骨髓动员的选择方案是合适的[11-12]。

综上所述，以G-CSF作为骨髓干细胞治疗肝硬化的动员剂，是一种有效获取骨髓干细胞的方法。采用动员后的骨髓源性干细胞治疗失代偿期的肝硬化患者，已经取得了初步的临床疗效。G-CSF动员过程中，采用合适的剂量和疗程，能够获得足够量并对人体安全的干细胞，方法简便、安全。

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4 Sakaida I,Terai S,Yamamoto N,et al.Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fi brosis in mice[J].Hepatology,2004,40(6):1304-1311.

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8 Yannaki E,Athanasiou E,Xagorari A,et al.G-CSF-primed hematopoietic stem cells of G-CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury,predominantly by promoting endogenous repair programs[J].Exp Hematol,2005,33(1):108-119.

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Safety and efficacy of intravenous injection of granulocyte colony stimulating factor for mobilization of autologous bone marrow stem cells in patients with decompensated cirrhosis

Wang Di,Guo Xiaozhong,Li Hongyu,Cui Zhongmin,Ren Linan,Zhao Jiajun,Shao Xiaodong,Wu Chunyan.Department of Gastroenterology,General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110086,China

Guo Xiaozhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo evaluate the safety and efficacy of autologous bone marrow stem cells mobilization by intravenous injection of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF) in patients with decompensated cirrhosis.MethodsFifty-one patients with decompensated cirrhosis received intravenous injection of G-CSF (4 μg/kg•d) before stem cell transplantation for 2 days.150-200 ml of bone marrow was harvested from each patient.FACS was used to evaluated CD34+ cells after mononuclear cells were isolated from the bone marrow.During the period of treatment,adverse events including bone pain,fever,gastrointestinal discomforts were recorded.Kidney and liver function were evaluated.Paired t-test was used to compare the parameters before and after G-CSF injection.ResultsAfter injection of G-CSF,peripheral white blood cells rose from (3.31±0.96)× 109/L to (11.35±1.92)× 109/L (P< 0.01).Bone marrow mononuclear cells were (1.91±0.83)× 109/kg and CD34+cells were (2.02±1.29)× 107/kg.The incidence of complications during G-CSF treatment was 17.6﹪ for fever and 6.90﹪for abdominal pain.Skin rash was observed in 2 patients.All patients recovered well within 2-3days without treatment..ConclusionsIn patients with decompensated cirrhosis,intravenous injection of G-CSF to mobilize autologous bone marrow stem cells is feasible and safe.

Decompensated cirrhosis；granulocyte colony stimulating factor；mesenchymal stem cells；stem cell mobilization；efficacy；safety

2014-08-05)

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.04.003

110086，沈阳军区总医院消化内科

郭晓钟，Email:guoxiaozhong1962@163.com

王迪，郭晓钟，李宏宇，等.粒细胞集落刺激因子对失代偿期肝硬化患者骨髓干细胞的动员效果及安全性观察[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(4):232-235.