自体骨髓间充质干细胞移植治疗难治性肝硬化腹水患者的临床疗效观察

王震凯 吴琳 魏娟 袁柏思 金鑫鑫 路又可 刘畅 刘炯 汪芳裕

•论著•

自体骨髓间充质干细胞移植治疗难治性肝硬化腹水患者的临床疗效观察

王震凯 吴琳 魏娟 袁柏思 金鑫鑫 路又可 刘畅 刘炯 汪芳裕

目的观察自体骨髓间充质干细胞（BMSC）移植治疗肝硬化难治性腹水的疗效及安全性。方法对2010年9月至2013年9月入住南京总医院消化内科经正规利尿、补充白蛋白达3个月以上且疗效欠佳的32例肝硬化腹水患者，在原有治疗基础上加用自体BMSC移植治疗，分别于治疗前、治疗后1个月及3个月观察腹围、体重、24 h尿量、血清尿素氮、肌酐、尿钠及血清蛋白浓度等指标变化。采用方差分析、配对t检验和Wilcoxon检验进行统计学分析。结果治疗前，患者体重、腹围、24 h尿量及血清尿素氮、肌酐、血清总蛋白、血清白蛋白及尿钠排出水平分别为（66.9±3.8）kg、（94.0±3.6）cm、（966±138.7）ml、（10.5±3.6）mmol/L、（112.4±30.6）μmol/L、（63.8±4.2）g/L、（32.1±2.7）g/L、（43.8±2.3）mmol/L；治 疗 后1个 月，分 别 为（66.0±3.9）kg、（93.0±3.6）cm、（1032±154.8）ml、（9.9±3.2）mmol/L、（104.8±25.6）μmol/L、（65.3±3.5）g/L、（32.6±2.9）g/L、（44.7±2.7）mmol/L；治 疗 后3个 月，分 别 为（56.2±3.7）kg、（80.5±4.5）cm、（1530±180.6）ml、（7.9±2.3）mmol/L、（88.7±22.2）μmol/L、（72.8±3.3）g/L、（39.2±1.5）g/L。3个组别8个指标均数比较有统计学意义（F= 78.194、117.689、120.527、6.558、6.712、54.827、83.421、493.776，均P= 0.000）。治疗后1个月与治疗前水平差异无统计学意义（t分别为0.587、0.636、0.559、0.556、0.678、0.522、0.611、0.592；P= 0.331、0.266、0.101、0.416、0.25、0.107、0.447）；而治疗后3个月，患者的体重、腹围较治疗前及治疗后1个月均明显减少，24 h尿量明显增加（与治疗前比较，t= 3.722、3.784、3.821，与治疗后1个月比较，t= 3.921、3.834、3.944，均P= 0.000），血清尿素氮、肌酐水平较治疗前及治疗后1个月均明显下降；而血清总蛋白、白蛋白及尿钠排出水平均明显升高（与治疗前比较，t= 2.182、2.338、2.182、2.412、2.136，P尿素、肌酐= 0.001，其余P= 0.000；与治疗后1个月比较，t= 2.392、2.283、2.194、2.331、2.442，均P= 0.000），治疗后1个月总有效率为18.75﹪，3个月后治疗总有效率达100﹪，疗效差异有统计学意义（Z = -5.014，P= 0.000），无严重并发症发生。结论自体BMSC移植术治疗肝硬化难治性腹水安全有效，且方法简便易行。

骨髓间充质干细胞；移植，自体；肝硬化；腹水

一直以来，失代偿期的肝硬化腹水缺乏有效的治疗方法，一旦出现难治性腹水，则预后极差，且患者的生活质量将会受到严重影响。近年来，越来越多的研究证实骨髓间充质干细胞（bone marrowderived mesenchymal stem cell,BMSC）在一定的微环境中，可向肝细胞或胆管细胞分化[1]，有助于改善肝硬化患者的肝功能，从而进一步改善肝硬化患者的临床症状。目前，间充质干细胞移植治疗已成为肝硬化治疗的热点。我科采用自体BMSC移植方法治疗32例肝硬化难治性腹水患者并取得良好疗效，现将临床观察结果报道如下。

资料与方法

一、病例选择

2010年9月至2013年9月入住我科并接受自体干细胞回输治疗的肝硬化腹水患者32例，其中男23例，女9例。年龄（56.55±4.46）岁，大于55岁20例，≤55岁12例，均未行脾切除术。乙型肝炎后肝硬化26例，混合性肝硬化（乙型肝炎+酒精性肝硬化）4例，酒精性肝硬化1例，血吸虫性肝硬化1例。Child-Pugh分级，Child B级21例，Child C级11例。所有患者术前存在不同程度乏力、纳差、腹胀、胸水、腹水、下肢浮肿、脾大等症状和体征。均经过影像学检查（包括腹部B超、CT或MRI）及各项检验，明确诊断为肝硬化。肝硬化诊断标准参照《中国肝病诊疗管理规范》白皮书[2]。所有患者入院后均给予对症、支持治疗。所有措施都在患者知情同意下进行，并签署相关知情同意书。

二、方法

进入手术室后，患者取平卧位，选取两侧髂后上棘部位为骨髓穿刺点，常规进行消毒后铺巾，在穿刺点部位以2﹪利多卡因进行局部浸润麻醉，直至骨膜处，然后使用18号骨髓穿刺针垂直穿刺，进入骨髓腔后予以固定，抽出骨髓。两侧穿刺点共抽取患者骨髓血200 ml，予以 7500 单位的肝素钠进行抗凝，然后在实验室利用密度离心方法进行骨髓干细胞的体外分离及纯化，使用流式细胞仪检测表面抗原标记为CD34-和CD45-且CD29+、CD44+、CD90+的浓缩的单核细胞，在病例组中采集的间充质干细胞均达到1.0×106/kg体质量，在4℃的保存条件下送至介入室。在数字减影血管造影机下，采用Seldinger技术，局麻下穿刺右侧股动脉，置入5 F动脉鞘，引入5 F R-H肝动脉导管，置于肝固有动脉，造影了解血管分布，进一步确定无肿瘤样异常血管团，然后将分离好的BMSC悬液缓慢注入肝内。术后拔出动脉鞘，加压包扎穿刺部位，平卧24 h，常规对症处理。分别于术后1个月及3个月返院随访各项指标。

三、观察指标

包括治疗前、治疗后1个月、治疗后3个月晨空腹时测体重、腹围、24 h尿量及尿钠排出量、血清肌酐和尿素氮、血清蛋白等指标。并记录腹胀、纳差、下肢浮肿等症状的改善情况。

四、疗效判定标准

1.显效：治疗后腹水基本消失和仅用少量利尿剂即可维持。

2.有效：治疗后腹水减少，但仍需要使用利尿剂及间断使用人血白蛋白方可维持。

3.无效：治疗后腹水无明显减少，仍需要依赖人血白蛋白及大量利尿剂。

五、统计学分析方法

采用 SPSS 20.0统计软件进行分析，肝、肾功能、生化资料以表示，治疗有效率资料以百分比描述，治疗前、治疗后1个月和治疗后3个月，3组均数资料比较采用方差分析，并进行组间两两比较采用配对t检验。疗效判定的等级资料采用Wilcoxon秩和检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、治疗前后患者的体重和腹围变化

从表1可见，治疗后1个月复查，发现患者体重、腹围虽较治疗前有所减少，24 h尿量有所增加，但无显著统计学差异（与治疗前比较，t= 0.587、0.636、0.559；均P> 0.5）；而治疗后3个月复查，患者的体重、腹围较治疗前及治疗后1个月均明显减少；同时，24 h尿量明显增加（与治疗前比较，t= 3.722、3.784、3.821；与治疗后1个月比较，t=3.921、3.834、3.944；均P< 0.001）。

表1 肝硬化患者骨髓间充质干细胞移植治疗前后体重、腹围、24 h尿量变化（± s）

表1 肝硬化患者骨髓间充质干细胞移植治疗前后体重、腹围、24 h尿量变化（± s）

注：与治疗前比较，aP< 0.05；与治疗后1个月比较，bP< 0.05

治疗时间 例数 体重（kg） 腹围（cm） 24 h尿量（ml）治疗前 32 66.9±3.8 94.0±3.6 966±138.7治疗后1个月 32 66.0±3.9a 93.0±3.6a 1032±154.8a治疗后3个月 32 56.2±3.7ab 80.5±4.5ab 1530±180.6abF值 78.194 117.689 120.527P值 0.000 0.000 0.000

二、治疗前后患者的肾功能、血清蛋白及尿钠排出量变化

从表2及表3可见，治疗后1个月及3个月患者血清总蛋白、血清白蛋白、尿钠排出水平及血清尿素氮、肌酐与治疗前水平比较，均有统计学意义，治疗后总蛋白、白蛋白及尿钠排出量均较治疗前升高，而血清总蛋白、白蛋白及尿钠排出水平均明显升高。

三、疗效比较

治疗后1个月复查，仅6例患者自觉腹胀、纳差、下肢浮肿等症状较治疗前改善，腹围较治疗前减小，尿量较治疗前增多，复查B超提示腹水较治疗前有所减少，继续使用利尿剂维持治疗；其余患者均无明显改善，仍需继续使用口服利尿剂及间断输注白蛋白（或血浆制品），按照疗效判定标准进行判定：显效0例（0﹪），有效6例（18.75﹪），无效26例（81.25﹪），总有效率不到20﹪。治疗后3个月复查，32例患者腹胀、纳差、下肢浮肿等症状较前改善，腹围较治疗前明显减小，尿量较治疗前明显增多，仅依靠少量利尿剂维持治疗。复查B超发现其中9例患者腹水基本消失。其余23例患者虽仍有腹水，但较治疗前明显减少，其中有1例患者仍需依靠间断输注白蛋白才能维持尿量。按照疗效判定标准进行判定：显效9例（28.1﹪），有效23例（71.9﹪），无效0例（0﹪），总有效率100﹪。采用Wilcoxon检验后，Z= -5.014，P= 0.000。说明经过治疗观察，3个月后的疗效优于1个月后疗效。

表2 肝硬化患者骨髓间充质干细胞移植治疗前后血清总蛋白、白蛋白及24 h尿钠变化（± s）

注：与治疗前比较，aP< 0.05；与治疗后1个月比较，bP< 0.05

治疗时间 例数 总蛋白（g/L） 白蛋白（g/L） 尿钠（mmol/L）治疗前 32 62.8±5.78 33.5±2.52 43.3±13.2治疗后1个月 32 64.6±3.37a 35.7±2.83a 50.2± 8.5a治疗后3个月 32 69.2±5.22ab 38.5±1.88ab 74.0± 9.4abF值 14.523 33.692 74.376P值 0.000 0.000 0.000

表3 肝硬化患者骨髓间充质干细胞移植治疗前后血清尿素、肌酐变化（± s）

表3 肝硬化患者骨髓间充质干细胞移植治疗前后血清尿素、肌酐变化（± s）

注：与治疗前比较，aP< 0.05；与治疗后1个月比较，bP< 0.05

肌酐（umol/L）治疗前 32 10.5±3.6 112.4±30.6治疗后1个月 32 9.9±3.2a 104.8±25.6a治疗后3个月 32 7.9±2.3ab 88.7±22.2abF值 6.558 6.712P值 0.003 0.002治疗时间 例数 尿素（mmol/L）

四、并发症

接受自体BMSC回输治疗的32例患者，有3例出现发热，经过抗感染治疗后体温恢复正常。其余患者的血压、心率等无明显变化，无发热、肝性脑病、消化道出血发生。

讨 论

存在难治性（或顽固性）腹水的肝硬化失代偿期患者可出现自发性细菌性腹膜炎、肝肾综合征等并发症，有甚者可导致呼吸困难等压迫症状[3]，从而严重影响生活质量及病情的发展。对肝硬化难治性腹水的治疗，以往采用反复大量放腹水及大量补充白蛋白的方法，给患者造成极大痛苦，而且医药费用高，疗效不肯定。腹水超滤浓缩回输治疗虽可迅速缓解腹胀、纳差甚至腹水的压迫症状，使患者的生活质量得到暂时改善[4]，但无法根本改善肝脏功能，因此远期疗效欠佳。

目前国内和国外许多临床研究结果提示，失代偿期肝硬化患者经过肝动脉插管输注自体BMSC，在随访过程中，患者丙氨酸氨基转移酶、胆红素指标逐渐下降，血清白蛋白、胆碱酯酶活性、胆固醇、凝血酶原活动度均增高，临床症状明显改善，无严重移植相关不良反应，说明该治疗在晚期肝病患者中的可行性[5-10]。本研究发现与上述研究的结果相似，在自体BMSC移植治疗后短期内临床症状及血清学检测结果均无显著改善，难治性腹水治疗有效率较低。而治疗后3个月患者的腹胀、纳差、下肢浮肿等临床症状开始出现显著改善。血清学检测提示所有患者的血清尿素氮、肌酐水平较治疗前及治疗后1个月均明显下降；血清白蛋白及尿钠排出水平均明显升高。治疗结果说明肝脏合成白蛋白的功能的改善是取得疗效的关键因素。由于干细胞的迁移、分化以及肝功能的重建需要过程，因此在治疗前期疗效不理想。在32例患者中，仅3例术后出现发热症状，经过抗感染治疗后体温均恢复正常，说明自体BMSC移植治疗安全可靠。

总之，自体BMSC移植治疗通过改善肝脏功能，使血清白蛋白水平显著提高，从而能有效地治疗肝硬化难治性腹水。同时,因为BMSC具有取材方便,价格低廉、安全可行，以及无伦理争议等优点[11]，已成为肝硬化难治性腹水一条新的治疗途径。

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3 Terai S,Sakaida I.Autologous bone marrow cell infusion therapy for liver cirrhosis patients[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2011,18(1):23-25.

4 王震凯,汪芳裕,刘炯,等.腹水超滤回输腹腔治疗肝硬化难治性腹水122例临床观察[J].医学研究生学报,2011,24(2):172-174.

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11 Takami T,Terai S,Sakaida I.Stem cell therapy in chronic liver disease[J].Curr Opin Gastroenterol,2012,28(3):203-208.

Clinical observation of hepatic cirrhosis patients with refractory ascites undergoing autologous bone marrow masenchymal stem cells transplantation

Wang Zhenkai,Wu Lin,Wei Juan,Yuan Bosi,Jin Xinxin,Lu Youke,Liu Chang,Liu Jiong,Wang Fangyu.Department of Gastroenterology and Hepatology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Chinese People's Liberation Army,Nanjing 210002,China

Wang Fangyu,Email:wangf65@yahoo.com

ObjectiveTo observe the effectiveness and security of hepatic cirrhosispatients with refractory ascites undergoing autologous bone marrow masenchymal stem cells transplantation.MethodsA retrospective study was conducted on 32 hepatic cirrhosis patients with refractory ascites.These patients had accepted diuretic therapy and supplement of human albumin over three months,but the therapeutic effect is poor.On the base of original treatment,all the patients accepted autologous bone marrow masenchymal stem cells transplantation.We observed respectively the difference of clinical symptoms,weight,and abdominal perimeter,24 h volume of urine,serum urea nitrogen,serum creatinine,serum total protein,serum albumin and urine sodium at pre-procedure,1 month and 3 months post-treatment.Analysis of two-way ANOVA,t test and Wilcoxon test were used in the study.ResultsAt baseline,body weight,abdominal perimeter,24 h volume of urine,serum urea nitrogen,serum creatinine,serum total protein,serum albumin and urin sodium were (66.9±3.8) kg,(94.0±3.6) cm,(966±138.7) ml,(10.5±3.6) mmol/L,(112.4±30.6) μmol/L,(63.8±4.2）g/L,(32.1±2.7)g/L,and (43.8±2.3) mmol/L,respectively.At 1 month post- transplantation,they were (66.0±3.9)kg,(93.0±3.6)cm,(1032±154.8)ml,(9.9±3.2)mmol /L,(104.8±25.6)μmol/L,(65.3±3.5)g/L,(32.6±2.9)g/L,and (44.7±2.7)mmol/L,respectively.At 3 month post- transplantation,they were (56.2±3.7)kg,(80.5±4.5)cm,(1530±180.6) ml,(7.9±2.3)mmol/L,(88.7±22.2)μmol/L,(72.8±3.3)g/L,and (39.2±1.5)g/L,respectively.There was significant difference among for all parameters at the three time points（F= 78.194,117.689,120.527,6.558,6.712,54.827,83.421,and 493.776 respectively,P= 0.000 for all).The improvement was no significant between baseline and at 1 month post-transplantation.There was slight improvement in the patients’ clinical symptoms,(t= 0.587,0.636,0.559,0.556,0.678,0.522,0.611,and 0.592 respectively;P= 0.331,0.266,0.101,0.416,0.25,0.107,and 0.4475 respectively).However,there was significant improvement at 3 months compared to both the base and 1 month post-transplantation(compared to baseline,t=3.722,3.784,3.821,2.182,2.338,2.182,2.412,and 2.136 respectively,P< 0.001 for all; compared to 1 month post- transplantation,t= 3.921,3.834,3.944,2.392,2.283,2.194,2.331,and 2.442 respectively,P= 0.000 for all).The rate of improvement was only 18.75﹪ at 1 month,but increased to 100﹪ at 3 months (Z= -5.014,P= 0.000).There was no severe complication.Conclusion Autologous bone marrow masenchymal stem cells transplantation is safe and effective for hepatic cirrhosis patients with refractory ascites.

Bone marrow masenchymal stem cells；transplantation，autologous；hepatic cirrhosis；ascites

2014-08-05)

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.04.002

210002 南京，南京军区南京总医院消化内科

汪芳裕，Email:wangf65@yahoo.com

王震凯,吴琳,魏娟,等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗难治性肝硬化腹水患者的临床疗效观察[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(4):227-231.