抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10单克隆抗体的制备及鉴定

于虹，王欣，，杨裔，陈万荣，郭彦，周育森，高基民 ，寇志华

1.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；2.温州医科大学检验医学与生命科学学院，浙江 温州 325035

随着临床上广谱抗生素、糖皮质激素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂的应用，各种侵入性诊疗技术的开展及HIV-1感染人群的日益增多，深部真菌感染的发病率自20世纪80年代以来上升了3～5倍[1]，在儿童中的感染报道也逐年增多[1-2]。真菌感染中以隐球菌感染最常见，其较高的病死率及呈上升趋势的发病率已引起临床医师高度重视。隐球菌属包括17个种和8个变种，其中新型隐球菌是主要的致病菌，包括新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隐球菌（C.gattii）。

新型隐球菌的致病力主要由其细胞壁的多糖荚膜所介导，荚膜相关蛋白是荚膜的必需组分[3-4]，包括CAP59[5]、CAP60[6]、CAP64[7]和 CAP10 等。继 CAP59、CAP60、CAP64之后，CAP10于1999年被发现并报道，其编码基因全长3150 bp，含3个内含子，表达产物为包含640个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量为73×103[8]，定位于细胞质，是新型隐球菌侵袭力的重要因素，但其功能尚不十分清楚。生物信息学分析表明，CAP10的N端70～250残基（aa）为主要致病菌新型隐球菌（血清型A、D、AD）的保守性片段[8]，在新型隐球菌感染诊断中可能具有重要的应用价值。因此，我们选择荚膜相关蛋白CAP10（70～250 aa）作为研制单抗的靶抗原，制备特异性抗CAP10抗体，同时对其进行鉴定，为临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周龄BALB/c雌性小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供；小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0为本室保存。HRP-山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司；ELISA显色液A、B及终止液购自北京万泰生物制药公司；弗氏佐剂、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司；PEG-1500购自Roche公司；HAT培养基、HT培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基均购自北京钮因华信科技发展有限公司。

1.2 重组蛋白的制备与纯化

[9]的方法，以IPTG诱导表达新型隐球菌抗原表位集中且保守性好的CAP10 70～250 aa片段（为与全长蛋白相区分，命名为CAP10-1），经镍柱纯化、复性，测定浓度后保存于-20°C备用

1.3 动物免疫

取纯化的重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合、乳化，皮下注射途径免疫6只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，10 μg/只，共免疫3次，每次间隔2周，首次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前3 d用无佐剂纯化蛋白10 μg加强免疫一次。首次免疫前和每次免疫后2周于尾静脉取血分离血清，-70℃冻存，分别作为阴性对照和每次抗体效价检测的血清标本，用ELISA方法检测血清抗体的效价。

1.4 杂交瘤细胞的融合及筛选

参考文献[10]的方法进行杂交瘤细胞融合与筛选。简言之，无菌条件下取免疫小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用PEG-1500按常规方法与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，用含HAT的1640完全培养基置37℃ 5%CO2的培养箱中；第4 d换液，7～10 d后以ELISA方法检测培养上清有无抗体产生，筛选阳性孔；进一步采用有限稀释法对阳性克隆进行连续3次的亚克隆，每次亚克隆采用含HT的1640培养基培养7～10 d，筛选出稳定、高水平表达特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.5 腹水制备及效价测定

筛选出的高表达阳性细胞经扩大培养，收集细胞，用生理盐水洗涤3次，并配制1×106/mL细胞悬液，腹腔接种于事先用石蜡油致敏的BALB/c雌性小鼠，0.5 mL/只，10～12 d 后开始采集腹水并离心分离，置-20℃保存；用纯化的重组CAP10-1包被，采用间接ELISA法检测腹水中的抗体效价。

1.6 单克隆抗体特异性鉴定

应用ELISA方法，分别用重组CAP10-1、大肠杆菌裂解蛋白、商品化的荚膜相关蛋白CAP59等抗原进行包被，以测定所制备单抗的特异性。以无关单抗腹水为阴性对照，HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，测定D450nm值，以D450nm≥2倍对照组D450nm平均值判断为阳性。

1.7 单克隆抗体亚类鉴定

用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒经间接ELISA鉴定制备的单克隆抗体的抗体亚类。以纯化后的重组CAP10-1为靶抗原，一抗为杂交瘤细胞上清，二抗为IgG亚类鉴定试剂盒里的酶标抗体（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、lambda、kappa），测定D450nm值。

1.8 酶联免疫法（ELISA）

用纯化的CAP10-1以终浓度2 mg/mL包被酶标板（Corning公司），50 μL/孔，置4℃过夜，次日用含10%小牛血清和0.05%Tween-20的PBS于37℃封闭1 h，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3次后加入稀释至一定浓度的样品（血清、细胞培养上清和腹水），50 μL/孔，37℃孵育1 h，洗涤3次后加入1∶5000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h，用PBST洗涤5次后TMB显色，判断结果。以D450nm≥2倍阴性对照D450nm平均值判断为阳性。

2 结果

2.1 BALB/c小鼠免疫后抗CAP10抗体的效价

按照前述方法免疫小鼠，初免前和加强免疫后2周自尾静脉取血分离血清，进行间接ELISA检测。从1∶4000进行倍比稀释，结果见图1，加强免疫后血清抗体效价大于50万。

2.2 杂交瘤细胞融合与单克隆抗体细胞株的筛选

图1 ELISA检测重组Cap10-1免疫小鼠后血清抗体效价

选取血清抗体效价最高的1号小鼠制备脾细胞，将制备的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，3 d后观察细胞融合效果；10 d后取上清液以间接ELISA进行筛选，以纯化的重组蛋白为靶抗原，挑选抗体效价高且单细胞集落的细胞株，共22株；将筛选的22株细胞株扩大培养，采用间接ELISA筛选D450nm值较高且为单细胞集落的细胞株，共15株；将此15株细胞株再次亚克隆，进行单细胞集落筛选，得到11株高特异分泌抗CAP10-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为抗CAP10-mAb-1～CAP10-mAb-11。11株细胞株经扩大培养，冻存于-80℃备用。

2.3 杂交瘤细胞培养上清效价的检测

采用间接ELISA，用纯化的重组蛋白包被，一抗为对11株杂交瘤细胞株进行培养所收集的上清，二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG，测定杂交瘤细胞上清的抗体效价，结果如图2，11株杂交瘤细胞株培养上清抗体效价最低为1280，最高大于40 960。

2.4 单克隆抗体的亚类鉴定

采用间接ELISA对筛选的11株细胞株进行亚型分析，用纯化蛋白包被，以细胞培养上清为一抗，IgG亚类鉴定的酶标为二抗。结果表明，制备的11株单抗均为IgG1亚型，轻链均为κ链。

2.5 抗CAP10单克隆抗体小鼠腹水的制备及抗体效价测定

将高表达的11株单克隆抗体细胞扩大培养后接种于BALB/c小鼠腹腔，10～12 d后收集腹水，离心取上清，按1∶2000进行倍比稀释后，用间接ELISA检测腹水中的抗体效价，结果如图3，11株单抗的效价均大于500 000。

2.6 抗体特异性鉴定

分别以纯化的重组CAP10-1、大肠杆菌裂解蛋白和商品化荚膜相关蛋白CAP59为对照抗原进行包被，采用间接ELISA对获得的11株单克隆抗体进行特异性检测，结果见图4，11株单克隆抗体均只与重组CAP10-1反应，与其他蛋白无交叉反应。表明制备的单克隆抗体是针对荚膜相关蛋白CAP10的特异性单抗。

3 讨论

CAP是新型隐球菌入侵人体、抵抗免疫系统、防御宿主清除的重要成分，是新型隐球菌重要的毒力分子，但其作用机制尚未完全揭示[3-7]。深入研究CAP的结构、功能及其与隐球菌致病力的关系，有助于了解新型隐球菌的致病机制，为隐球菌病的治疗提供新的思路，同时也为隐球菌病的诊断及转归提供评价指标。制备高效价的抗体是检测新基因表达和研究新基因功能的前提，目前国内外尚无CAP10蛋白单克隆抗体制备的报道。研制高效、特异的抗CAP10的单克隆抗体，不但有助于进一步探讨其功能，对新型隐球菌的临床诊断和血清分型也具有重要意义。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有纯度高、特异性强的特点，是研究病原体致病机制、诊断和治疗的重要工具。我们采用体内诱生方法制备单克隆抗体，用纯化的CAP10免疫BALB/c小鼠，当小鼠抗体效价达到适当水平时，经ELISA检测选取血清抗体效价最高的小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合[10]。小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0是经8－氮杂鸟嘌呤（8-azagunine，8-AG）诱导产生的，缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），利于融合细胞的筛选，且本身不分泌IgG链，有利于抗体同种型的鉴定。目前用于诱导细胞融合的方法有病毒、化学试剂及电脉冲，其中聚乙二醇（PEG）为常用的诱导细胞融合的化学因子。PEG的相对分子质量和浓度是影响融合效率的重要因素，一般在融合过程中选择相对分子质量为1000～4000的PEG，浓度为30%～50%时均可获得最佳融合效果。但PEG可使细胞膜产生不稳定性，有一定的毒性。本研究选取PEG-1500诱导融合因子，结果表明其融合率可达100%。

图2 杂交瘤细胞上清效价检测

图3 腹水抗体效价测定

图4 11株单抗的特异性分析

融合后，杂交瘤细胞因为染色体数较正常多一倍，细胞状态不稳定，在瘤细胞分裂时染色体的分配不平衡，可能会造成杂交瘤细胞在增殖过程中抗体分泌能力的丢失。为获得稳定表达的单克隆抗体杂交瘤细胞，我们采用2次亚克隆的方法。首先，用间接ELISA检测第一次融合的细胞上清，选择D450nm值较高且培养孔中为单个细胞集落的杂交瘤细胞进行亚克隆，从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，采用有限稀释法使每孔只有一个细胞[11]。然后，对阳性分泌孔进行2次亚克隆，收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，最后得到了11株稳定分泌高特异性抗CAP10单克隆抗体的杂交瘤细胞株。随后，将11株杂交瘤细胞于腹腔注射BALB/c小鼠，获得了含有单克隆抗体的腹水，间接ELISA检测结果显示每株单抗腹水的效价大于50万，亚型鉴定表明11株杂交瘤细胞株都为IgG1，轻链为κ型[12]，而且11株单抗仅与重组CAP10-1特异性结合，与其他抗原无交叉反应，说明针对该片段的单克隆抗体可用于新型隐球菌的致病机制研究，并可能用于新型隐球菌的检测和分型。抗CAP10单克隆抗体的制备，为深入研究CAP10的生物学功能，建立新型隐球菌感染的诊断方法奠定了基础。

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