用环介导等温扩增技术快速检测粪便样本中的沙门菌

刘威，李环，邹大阳，杨展，赵向娜，李雪莲，崔茜，王思淼，黄思妺，闫夏贝，魏晓，王雪松，尹志涛，黄留玉，袁静

军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

据统计，在世界各国多种类细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首[1-3]。过去的一个世纪，中国作为一个主要的食品生产商和消费者，人均消费的食物大幅增加。根据食源性疾病暴发的报告，1992～2005年，在细菌性食源性疾病暴发中沙门菌病是第二大原因，每年约10%～20%的暴发是由沙门菌引起的[4]。食源性沙门菌常导致腹泻，更好地控制沙门菌感染需要敏感和快速的检测方法。虽然传统的分离培养沙门菌的方法仍被广泛使用，但所需检测时间超过3 d[5-6]。以PCR为基础的快速检测沙门菌的分子技术已经建立[7]。但PCR鉴定有几个固有的缺点，如对试验条件要求较高，需要昂贵的仪器设备和专业人员，且操作相对复杂，更为重要的是检测成本高，只有专业检测实验室才能进行，基层单位难以开展。因此，开发一种操作简便、特异性高、灵敏度好、检测快速、成本低廉、适于基层推广的检测方法，对沙门菌的监控将起到积极作用。最近发展的环介导等温核酸扩增技术（loop-mediated isother⁃mal amplification，LAMP）是一种新的分子生物学方法，它在等温条件下实现核酸扩增[8-9]。LAMP技术的反应原理是，根据序列保守区域设计的一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，在60～65℃范围60 min内大量合成目标DNA，同时伴随副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，且核酸扩增过程在等温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备即可满足反应要求，检测成本大大降低。目前，LAMP技术在临床诊断[10]、细菌或病毒的定性和定量检测[1,11-15]、性别鉴定[16]和其他方面得到广泛应用。已有研究结果表明,invA基因是沙门菌独有的基因，也是PCR检测沙门菌的一个目标基因[17]。因此，我们选择invA基因作为LAMP法检测沙门菌的目标基因，拟以LAMP法为基础对粪便样本中的沙门菌进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用菌种见表1，各菌株在脑心浸液肉汤（BHI）中于37℃培养；Bst大片段DNA聚合酶（New England Biolabs公司）；总DNA提取纯化试剂盒（Promega公司）；dNTP（Pharmacia公司）；Chelex-100、甜菜碱（Sigma公司）；硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、EDTA、硫酸铵（国药集团化学试剂有限公司）；Tris-HCl（上海生科生物科技有限公司）；Triton X-100（北京美莱博医学科技有限公司）；NP-40（FLU⁃KA公司）；羟基萘酚蓝（HNB）（Regal Biotechnology公司）；2×Tap MIX（天根生化科技（北京）有限公司）；琼脂糖（AMRESCO公司）；引物由北京奥科鼎盛生物有限公司合成。

PCR扩增仪，凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；分光光度计（NanoDrop ND-1000）；实时浊度仪LA-320c（日本荣研化学株式会社）；等温金属浴（杭州博日科技有限公司）。

1.2 细菌菌株和准备的模板

将细菌分别接种于5 mL对应的培养基中，按照细菌最适宜生长温度培养过夜。用Chelex法提取细菌总DNA：取500 μL细菌悬液，10 000 r/min离心2 min，弃上清，加入500 μL双蒸水，再加入等体积的 Chelex法 DNA提取液（25 mmol/L NaOH，10 mmol/L Tris-HCl，1%Triton X-100，1%NP-40，0.1 mmol/L EDTA，2%Chelex-100），于沸水中沸煮10 min，转入4℃放置5 min，14 000 r/min离心2 min，上清液在LAMP和PCR反应中[18]用作模板。

1.3 引物设计

从NCBI数据库中获得已知的invA基因序列（NC_003197.1），用Primer Explorer v4软件（http://primerexplorer.jp/LAMP）进一步分析序列，设计外环正向引物（F3）、外环反向引物（B3）、内环正向引物（FIP）、内环反向引物（BIP），额外的2个环引物（LF和LB）是为了加速放大反应（表2）。FIP和BIP设计时添加了4个胸腺嘧啶（TTTT）。与PCR比较其敏感性和特异性，PCR引物为SM127B3和SM127F3。

表1 特异性LAMP实验所用菌种

表2 扩增invA基因的LAMP引物及序列

1.4 LAMP反应

配制25 μL LAMP反应体系，包含20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、10mmol/L KCl、10mmol/L（NH4）2SO4、0.1%Tween-20、0.8 mol/L 甜 菜 碱 、8 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTP 和 8 U Bst DNA聚合酶。需要40 pmol引物FIP和BIP、20 pmol引物LF和LB、5 pmol引物F3和B3。最后，添加适当数量的DNA模板到反应管中。反应须在63℃恒温浴中进行50 min，80℃灭活5 min。

1.5 LAMP结果检测

LAMP过程发生如下化学反应：

其中，Mg2P2O7即焦磷酸镁为白色沉淀。依据此原理，日本荣研化学株式会社开发出实时浊度仪LA-320c，每隔6 s测定反应管的浊度并绘制曲线，判断反应的阴阳性。

HNB是一种金属离子指示剂，依赖反应液中镁离子的变化而呈现不同的颜色，阴性时为紫色，阳性时为天蓝色。使用时将HNB配制成2.4 mmol/L的反应液[17]，-20℃保存备用。

1.6 PCR检测

图1 LAMP反应检测8株已知非沙门菌的特异性

25 μL PCR反应体系包含12.5 μL PCR主混合试剂（天根公司）、1 μmol/L SM127F3和SM127B3引物和相同数量的DNA模板。反应参数为95℃预变性5 min，然后以95℃变性30 s、55.5℃退火30 s、72℃延伸30 s进行35个循环，72℃延伸10 min。取PCR产物5 μL，在1%含EB的琼脂糖凝胶中电泳（120 V，35 min），用凝胶成像系统检测。

2 结果

2.1 特异性的LAMP试验

选出8株已知非沙门菌和16株沙门菌分别进行LAMP扩增。当反应体系中存在沙门菌的特定基因时发生LAMP扩增反应，产生大量焦磷酸镁白色沉淀，反应液的浊度上升，在图中表现为曲线上升，可以看出只有沙门菌曲线上升，所有非沙门菌菌株LAMP反应显示阴性。表明这套引物具有良好的特异性。反应前加入1.25 μL 2.4 mmol/L的HNB，只有沙门菌反应管的颜色变成了天蓝色，示为阳性，其他菌株均为紫色，示为阴性，也说明设计的引物具有良好的特异性。见图1、2。

图2 16株沙门菌的特异性检测

2.2 灵敏度的LAMP试验

为了确定设计的引物用于检测沙门菌的敏感性，用基因组DNA提取试剂盒提取肠炎沙门菌的基因组DNA，1/10梯度稀释后用于LAMP、PCR，结果见图3。浊度仪检测和HNB检测均得到相同结果，LAMP检测的最低限度约6.97 pg/μL，PCR检测限度约69.7 pg/μL。

2.3 粪便样品的LAMP检测方法评估

进一步用LAMP法分析评估检测粪便样本的敏感性。将肠炎沙门菌DNA梯度稀释后与粪便样品混匀，进行LAMP，结果见图4。浊度仪检测和HNB检测均得到相同结果，都与纯样品有相同的灵敏度。因此，我们可以得出结论，2种检测方法有相同的灵敏度。用相同的模板，采用PCR鉴定没有达到我们的目标，目标片段并不清楚（图4C），这是因为粪便中的杂质影响所致。

3 讨论

图3 LAMP法和PCR法的灵敏度比较

用LAMP法可以在恒温条件下于1 h内通过扩增细菌的一个目标基因来检测细菌，大大节约了时间和劳动力成本，已有许多采用LAMP检测病原菌的文献报道，包括大肠杆菌O157∶H7、单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌[19-21]。在本研究中，我们设计了针对沙门菌特异基因invA的LAMP引物，并用该引物灵敏、快速地检测到沙门菌。用Chelex法提取基因组DNA，整个处理时间不超过20 min，反应过程快捷，只须将反应混合液在60℃～65℃恒温条件下保持60 min即可完成。现在国内大多数研究者在检测LAMP反应结果时往往选择对反应结果进行电泳或在反应完成后添加SYBR GreenⅠ荧光染料，这2种方法都使反应产物暴露于空气中，污染了环境，极其容易造成假阳性，而且电泳法检测并不能实时反映LAMP反应过程。我们采用实时浊度仪和HNB检测，反应完成后不开盖，很好地杜绝了污染，有效防止了假阳性。

综上，我们应用LAMP法对沙门菌进行了快速检测，特异性强，灵敏度高。LAMP法虽然扩增原理复杂，但操作简便、用时少、灵敏度高、特异性强，再加上其等温反应条件，因此适用于检验检疫部门和卫生医疗单位对沙门菌的检测，并有望成为简易的常规检测手段应用于基层单位。

图4 LAMP法和PCR法检测粪便样本中肠炎沙门菌的灵敏度比较A：LAMP法浊度仪检测结果；B：LAMP法HNB显色结果；C：PCR法检测结果；M：D2000 DNA marker；1～8：肠炎沙门菌基因组DNA浓度 依 次 为 69.7、6.97、0.697 ng/μL 和 69.7、6.97、0.697、0.0697、0.00697 pg/μL

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