腺病毒55型抗原表位分析及评价

李鹏飞，陈堃，修冰水，张庆波，张贺秋

1.河北联合大学，河北 唐山 063000；2.军事医学科学院 基础医学研究所，北京 100850

腺病毒（adenovirus，Ad）包括1～55血清型[1]，能引起急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎和急性间质性肾炎等多种临床症状[2]。我国常见的呼吸道传播的腺病毒类型主要为3型、7型[3]。腺病毒可以引起呼吸道感染暴发，特别是生活在军队、学校等封闭环境内的人群[4-5]。2006年，陕西省岐山县中学暴发急性呼吸道疾病疫情；2012年2月，河北保定解放军252医院发生聚集性疫情。经鉴定，这2起集中发热事件均由腺病毒55型（Ad55）感染所致。Ad55是由Ad11与Ad14基因重组而形成的新型毒株[6]，其临床表现新特征，如发热38.5℃以上、流鼻涕、咽痛、咳嗽、伴有呼吸困难，可能更易于暴发流行，一度被怀疑为SARS、甲流、禽流感[7]，可引起公众恐慌。由于缺少有效的针对腺病毒的治疗手段和疫苗，因此针对呼吸道症候群，研制包含Ad55在内的广谱性腺病毒早期快速诊断试剂，对疾病预警、确定隔离人群，控制疾病传播具有重要意义。

人腺病毒基因组长约36 kb，其衣壳呈规则的20面体结构，由六邻体、五邻体和纤突等蛋白组成复合结构[8-9]。六邻体含有型、组和亚组抗原决定簇，是诊断不同血清型的标准[10]。六邻体含有重要的中和性抗原表位，也是疫苗研究的重要靶点[11]。纤突有血清特异性，且含有体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。有研究显示，纤突抗体的产生略早于六邻体[12]，因此，纤突抗原在早期诊断中具有重要地位。由于Ad55发现较晚，有关其抗原表位分析尚未见报道。我们用生物信息学技术预测了Ad55六邻体和纤突抗原表位，为研制包括Ad55在内的腺病毒血清学检测和疫苗提供免疫学基础。

1 材料和方法

1.1 材料

47份疑似腺病毒呼吸道感染临床样本血清由本室保存；48份正常人血清样本来自北京血站红十字血液中心；大肠杆菌HB101和表达载体pBVIL-1由本室保存；Taq DNA聚合酶为北京百泰克生物技术有限公司产品；T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；DNA限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购自Pro⁃mega公司；配制LB培养基的胰蛋白胨及酵母提取物购自本院条件处；PCR产物回收试剂盒由北京百泰克生物技术有限公司生产。引物全部由上海英骏生物技术有限公司合成；DNA序列测定由中美泰和生物技术有限公司完成。

1.2 抗原表位分析

从 NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下载Ad55的氨基酸序列，运用Biosun生物软件比对序列，分析六邻体、纤突的抗原表位情况，确定克隆表达的表位区间。

1.3 引物设计与基因合成

根据抗原表位的氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子设计并优化优势抗原表位区间的基因（分段设计并合成引物，采用重叠延伸PCR方法合成各基因片段，并逐步将各片段搭桥扩增，最终得到完整的优势抗原区间基因）。

1.4 原核表达载体的构建

设计含酶切位点的上下游引物，对上述基因进行PCR扩增，从而在基因片段两端引入酶切位点，经双酶切后插入经同样酶切的表达载体pBVIL-1，转化大肠杆菌HB101，挑选鉴定阳性克隆并测序。

1.5 抗原表达与纯化

鉴定出的阳性克隆在37℃培养过夜后，转至新鲜的LB培养基，37℃培养2～3 h，至D600nm值为0.4～0.6，42℃诱导表达4 h以上，离心收集菌体，用TE缓冲液冲洗菌体并悬起，超声波破碎细胞，离心收集上清，用阴离子交换柱Sephrose 4B和分子筛Sephdex G50纯化抗原，SDS-PAGE鉴定各步分离产物。

1.6 间接ELISA法评价Ad55主要抗原表位活性

以纯化的Ad55主要抗原表位蛋白包被酶联板，用间接ELISA法对疑似患者和正常人血清样本进行测定，根据D450nm值计算S/c，评价重组抗原的反应活性。

2 结果

2.1 序列比对与抗原表位选择

运用Biosun生物软件预测Ad55六邻体、纤突蛋白抗原表位，表位峰值较高的区段如图1中横线所示，Ad55六邻体含有4个连续表位（130～190、180～240、230～280和270～322 aa，以下分别称为表位1～表位4）和2个非连续表位（410～460和620～680 aa，以下分别称为表位5、表位6），纤突含有2个主要抗原表位（135～165和210～260 aa，以下分别称为表位7、表位8），作为克隆表达的目的序列。

2.2 抗原表达与纯化

测序结果显示基因插入正确。将测序正确的表达菌株进行大量诱导表达，超声波裂解后的菌悬液几乎无沉淀，经SDS-PAGE鉴定，8个融合Ad55蛋白为包涵体形式表达，纯化后，其纯度可达95%以上。

2.3 间接ELISA评价8个融合Ad55蛋白的抗原性

以纯化的融合Ad55蛋白包被酶联板，用间接ELISA初步检测48例正常人和47例疑似患者的血清，ROC曲线分析结果见图3。其中表位4、5和8的ROC 曲线下面积（AUC）分别为 0.76（P＜0.05）、0.77（P＜0.05）和0.81（P＜0.05），具有一定的诊断意义。

2.4 3种Ad55诊断抗原的变异分析

考虑到腺病毒具有多个血清型，我们对筛选的表位4、5和7等3个Ad55表位与其他血清型之间的变异情况进行了比较，主要筛选了临床具有呼吸道症状，且在我国有流行传播的3、7、11和14共4种血清型，结果见表1。筛选的Ad55表位与不同腺病毒血清型之间的序列同源性并不相同，3个Ad55表位均与Ad11相关表位之间的同源性最高，与Ad3的同源性最低，提示3个表位除了可检出Ad55外，对Ad11也有相同的检出能力。表位7除了与Ad3差异较大外，与Ad7、Ad11、Ad14其他型别之间具有较高的同源性；表位5除了与Ad11高度同源外，与Ad3、Ad7、Ad11存在较大差异，是最有可能具有Ad55血清学特异性的抗原。这一结果提示，可通过一定的抗原组合达到针对多种腺病毒血清型的检测目的。

图1 Ad55六邻体（A）和纤突（B）的抗原表位分析

3 讨论

腺病毒在我国上世纪50～60年代出现过大规模流行，其中儿童感染肺炎死亡率高达30%[13]。沉寂了半个世纪后，近些年国内又暴发了多起腺病毒感染造成的集体发热疫情。由于腺病毒引发的肺炎症状并不典型，且对抗生素不敏感，一度被怀疑为SARS、甲流、禽流感等，给公众造成一定的恐慌，因此，对腺病毒的早期诊断具有重要意义。

图2 8种Ad55表位抗原的纯化M：蛋白marker；1～8：依次为表位1～8

图3 8种Ad55表位抗原检测的ROC曲线

表1 Ad55筛选表位氨基酸序列的同源性分析

目前针对腺病毒的检测主要是基因检测，具有灵敏度高、能分型等特点[14]，但操作复杂，仪器昂贵，无法用于基层。20世纪60年代临床建立的以免疫荧光为主的腺病毒抗原检测，主要针对3型和7型,往往难以检测新的腺病毒血清型[15]。本研究针对新发腺病毒55开展相关抗原研究，为研发广谱性腺病毒免疫学检测技术打下基础。

Ad55是由腺病毒11型与14型基因重组形成的新型毒株[3]，是新发传染病原。我们初步用疑似腺病毒感染者血清筛选出3个Ad55抗原表位，序列比较结果提示Ad55抗原与Ad11高度同源，与Ad3、Ad7的同源性较差。因此，针对Ad3、Ad7的单抗无法识别新发的Ad55表位，是造成Ad55漏检的主要原因。本研究获得的3个表位，特别是135～165 aa表位，与除Ad3型外所有的腺病毒血清型高度同源。因此，补充Ad3型相关表位，联合本研究筛选的表位，能提高检测腺病毒血清型的覆盖面，最终为研制包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad55在内的我国通用性呼吸道症状腺病毒的免疫检测奠定基础。

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