水母雪莲培养细胞对糖尿病小鼠血糖的影响

袁菊芳，邱业峰，王艳静，李敏，温珠明，范玉筠，叶华虎

1.军事医学科学院 实验动物中心，北京 100071；2.四川省人民医院·四川省医学科学院，四川 成都 610072；3.北京城市学院，北京 100094

糖尿病是以血糖升高为主要特征的慢性代谢性疾病，随着病程进展，引起全身代谢紊乱，继发重要脏器的不可逆损害，其死亡率仅次于肿瘤和心血管病[1]。近年来，国内外对具有降糖作用的植物的多糖化学和药理研究进展迅速。水母雪莲为菊科植物水母雪兔子的全草，我国将其列为三级保护植物，具有较高的药用价值，对风湿性炎症、肿瘤、月经不调、白带增多等病症的疗效明显[2-4]。水母雪莲产自海拔4000～6000 m的高寒缺氧、无污染的雪域地区，由于其生存环境特异，生长速度缓慢，人工栽培困难，加之过度采挖，目前该物种濒临灭绝，严重影响了以雪莲为主要原料的药物的开发与生产。近年来，军事医学科学院生物工程研究所采用生物工程方法，诱变筛选了一株黄酮产量高、培养条件相对简单、增殖能力较快、遗传稳定的水母雪莲细胞突变系[5]。有关水母雪莲降血糖方面的作用尚未见报道。我们以自发性糖尿病KKay小鼠为模型，观察了水母雪莲培养细胞的降血糖作用；同时，利用糖耐量和血清生化指标初步探讨了其作用途径。

1 材料与方法

1.1 材料

雌性KKay小鼠及高脂饲料均购自中国医学科学院实验动物研究所（质量合格证号：SCXK京2009-0004）；水母雪莲细胞培养物由军事医学科学院生物工程研究所提供；盐酸二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）；日立7600型全自动生化分析仪（日立公司）；One Touch血糖仪及血糖试纸（强生公司）；血清胰岛素由解放军总医院原子能研究所采用放射免疫法测定。

1.2 动物分组及给药

KKay小鼠由专用高脂饲料饲喂，待动物生长到10～12周龄，用血糖试纸测定血糖含量，选取血糖值在14.5 mmol/L以上的为糖尿病模型小鼠。依据动物体重和血糖值指标，随机分为3组，每组10只。3组动物分别灌胃水母雪莲细胞培养物（100 mg/kg）、二甲双胍（250 mg/kg）和生理盐水（0.2 mL/10 g），每天1次，每周给药6 d。

1.3 血糖值测定

每周测定动物血糖并称重。在测定血糖前，动物先禁食3 h（不禁水），然后给药，继续禁食3 h，断尾取血，用血糖仪测定动物的血糖。

1.4 糖耐量实验

将连续灌胃6周的KKay小鼠先禁食3 h，测量空腹血糖（计为0点），然后按剂量一次性灌胃雪莲、二甲双胍和等量生理盐水，给药后30 min腹腔注射50%葡萄糖（2 g/kg），分别在注射葡萄糖后30、60、120 min测量血糖，并计算曲线下面积（AUC）。AUC=1/4×空腹血糖＋1/2×30 min血糖＋3/4×60 min血糖＋120 min血糖。

1.5 药物的时-效关系测定

将连续灌胃6周的KKay小鼠在不禁食环境下一次性给药，分别于给药后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h测量血糖。

1.6 血清生化指标测定

模型小鼠连续给药6周，末次给药后空腹3 h，摘眼球取血，分离血清，用全自动生化仪测定总胆固醇（CH）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU），用放射免疫法测定血清胰岛素。

1.7 统计学方法

实验结果以x±s表示，数据采用SPSS软件进行统计分析。

2 结果

2.1 雪莲培养细胞对KKay糖尿病小鼠体重的影响

3组动物体重随时间延长而逐渐增重，其中对照组动物体重增加幅度最大，二甲双胍组次之，雪莲组动物增加幅度最小。统计学分析表明，从给药后第2周开始，水母雪莲组动物体重明显低于对照组（P＜0.05），而2个实验组动物的体重差异不明显。

2.2 雪莲培养细胞对KKay糖尿病小鼠血糖的影响

3组动物给药后的血糖测定结果显示，对照组动物在整个实验期间血糖值一直维持在高水平状态（14.91±1.21～17.85±2.08 mmol/L），而水母雪莲组和二甲双胍组动物在给药7 d后，血糖值明显下降，且持续维持在较低水平（二甲双胍组为 7.30±1.36～8.02±1.12 mmol/L，水母雪莲组为 8.95±0.71～9.51±1.36 mmol/L）。统计分析显示，给药1周后，水母雪莲组和二甲双胍组动物的血糖值相当，都显著低于对照组（P＜0.01)。

表1 水母雪莲对KKay小鼠体重的影响（x±s，n=10）

表2 饲喂水母雪莲后3 h小鼠的空腹血糖（x±s，n=10）

2.3 雪莲培养细胞灌胃后不同时间点KKay小鼠的血糖值变化

药物的时-效关系测定结果显示，对照组动物在20 h内持续处于高血糖水平（血糖值为18.38±1.82～23.43±3.01 mmol/L），而雪莲组和二甲双胍组动物都出现“U”形变化趋势，即在给药后一段时间血糖值下降，在低血糖水平维持一段时间，最后再升高。其中，二甲双胍在给药后2 h即可见血糖明显下降，6 h血糖值最低（为7.26±1.80 mmol/L），14 h后逐渐恢复到药前水平；雪莲组动物的血糖值明显下降出现在药后6 h，14 h达到最低（为5.95±1.25 mmol/L），20 h左右逐渐恢复到给药前水平（图1）。

2.4 雪莲培养细胞对KKay糖尿病小鼠糖耐量的影响

3组动物的糖耐量测定结果显示，水母雪莲组动物空腹3 h的血糖值最低，二甲双胍组次之，对照组最高，且3组间有统计学差异。注射葡萄糖后，3组动物血糖值高点都出现在注射后30 min，此后血糖值开始下降，对照组在120 min时逐渐降到给药前水平，而水母雪莲组和二甲双胍组的血糖值呈继续下降态势。提示水母雪莲组和二甲双胍组动物的糖代谢能力得到显著改善（P＜0.01）。

2.5 雪莲培养细胞对KKay糖尿病小鼠生化指标的影响

3组动物的4项生化指标测试结果显示，雪莲组动物的血糖、甘油三酯、胆固醇和血清胰岛素水平显著低于对照组（P＜0.01）；二甲双胍组动物的血糖和甘油三酯水平也低于对照组（P＜0.01），但胆固醇和血清胰岛素水平与对照组差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

图1 给药后不同时间点动物血糖变化与对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01

表3 不同实验组动物的糖耐量实验结果（x±s，n=10）

表4 水母雪莲对KKay小鼠4项生化指标的影响（x±s，n=10）

雪莲是名贵中药材，我国利用雪莲已开发出了多种中成药、保健性食品（饮品）、美容及护肤品。鉴于雪莲自然产量的减少和不足，军事医学科学院生物工程研究所胡显文课题组建立了雪莲细胞悬浮培养方法，实现了雪莲细胞的人工培育，同时利用生物工程技术诱变并定向筛选获得高黄酮含量的稳定突变细胞系。功能研究初步发现，雪莲细胞培养物有明显的血脂调节作用，并具有糖代谢调节功能。

为了进一步研究雪莲细胞培养物的降糖作用及其可能的作用机制，我们以国内外广泛使用的Ⅱ型糖尿病模型动物KKay小鼠[6-7]为对象，通过多种指标测试，评价了雪莲细胞培养物的降糖效果，并探索其可能的作用机制。结果显示，雪莲细胞具有明显的降糖作用。KKay小鼠饲喂雪莲7 d后，动物的血糖值明显下降，且在此后的5周时间内一直维持在较低水平（8.95±2.71～9.52±2.88 mmol/L），其效应与阳性药物二甲双胍类似（7.30±1.36～8.02±2.12 mmol/L）；而在此期间，生理盐水对照组动物的血糖值波动于14.91±2.11～17.85±2.08 mmol/L，统计学差异显著（P＜0.01)。另外，我们发现如空腹时间短（＜5 h），小鼠的血糖值变化幅度较大，6～8 h处于相对平稳期，超过8 h变化幅度又将增加（该部分数据未显示），因此以空腹6 h作为血糖测定的最佳时间。

实验进一步发现，雪莲细胞培养物的降糖作用具有起效时间长、作用持久等明显的中药特点。给连续灌胃6周的动物一次性给药，测定动物20 h内的血糖变化，结果显示，生理盐水对照组血糖值持续处于高水平（18.38±1.82～23.43±3.01 mmol/L）；而雪莲细胞组动物的血糖值变化呈“U”字形，即给药后6 h开始下降，14 h达最低（5.95±1.25 mmol/L），20 h左右逐渐恢复到给药前水平；阳性药物二甲双胍的变化态势与雪莲细胞组相似，但其效应快于雪莲组，即给药后2 h血糖开始下降，6 h血糖值最低（7.26±1.80 mmol/L），14 h后逐渐恢复到给药前水平。

糖耐量实验结果显示，雪莲细胞组和二甲双胍组动物的糖代谢能力得到明显改善，2个实验组的AUC值分别为40.79±3.33和31.48±2.70，显著低于对照组的56.32±4.07。血清生化指标检测结果显示，雪莲细胞组动物的血清胰岛素水平由对照组的101.91±12.23 μU/mL 下降到 74.86±8.96 μU/mL，该指标也低于二甲双胍组的 93.73±10.19 μU/mL（P＜0.05）。此外，雪莲细胞组动物的血清甘油三酯和胆固醇水平也明显下降。上述结果表明，雪莲细胞培养物能有效提高胰岛素的敏感性，降低胰岛素抵抗，从而达到降糖作用；同时也提示雪莲细胞有明显的脂肪代谢调节功能，与杨波的前期报道类似[8]。

糖和脂肪代谢虽然各有其主要途径，但在动物机体内，糖和脂肪代谢又相互关联[9-10]。本实验结果表明，雪莲细胞培养物既通过提高胰岛素的敏感性调节糖代谢，又可调节血脂代谢。但雪莲细胞培养物的降糖作用是通过胰岛素途径（降低胰岛素抵抗或提高胰岛素敏感性），还是通过血脂代谢间接影响血糖，或者是二者的共同作用结果，还有待于进一步的研究。

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