绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

蒋东，唐银琳，陶晨陈，吴耀生

广西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，广西 南宁 530021

萜类化合物是一类以异戊二烯为结构单元的天然烃类化合物，分布广、种类多、结构多样，是重要的植物初生代谢产物和次生代谢产物，在植物的生长发育、自身免疫和防御反应中起重要作用，同时也广泛应用于工业、医药卫生等领域[1]。绞股蓝、三七、罗汉果等中草药的主要活性物质为萜类化合物。法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophaophate synthase，FPS，EC2.5.1.10）是一种异戊烯基转移酶，是类异戊二烯途径的一个关键酶，催化五碳原子的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）以1-4头尾连续缩合反应，形成15碳的法呢基焦磷酸（FPP）[2]，FPP是植物体内许多萜类物质合成的前体。目前已从罗汉果、三七、积雪草、青蒿等40多种植物中分离并克隆了FPS的cDNA序列。绞股蓝以三萜皂苷为主要有效成分，研究其生物合成通路中的关键酶，是改变或调控其三萜皂苷合成通路，以提高有效成分含量和药用价值的重要环节。

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum Thunb.Ma⁃kin）为葫芦科绞股蓝属植物，又名遍地生根、公罗锅底、七叶胆等，始载于《救荒本草》，《本草纲目》、《植物名实图考》、《实用中草药手册》中均有记载。绞股蓝全草入药，具有抗肿瘤、降血脂、抗衰老、护肝、增强免疫等作用[3]。目前对绞股蓝的研究主要在有效成分的分离提取及其药理作用方面。绞股蓝三萜合成通路及相关酶的基因克隆、分子进化等方面也有一些报道，如绞股蓝鲨烯合酶（SS）及鲨烯环氧酶（SE）[4]。绞股蓝具有较强的生态适应性，自然分布于我国秦岭和长江以南地区，广西大部分地区都有分布，资源丰富。因此，对其进行系统研究，对我区绞股蓝资源的合理利用和开发具有重要意义。

随着蛋白质组学和转录组学等领域的兴起，以mRNA为基础的研究越来越受到关注，但mRNA在体外稳定性差，将其反转录为cDNA是一种有效的解决方法。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplifi⁃catiion of cDNA ends，RACE）是一种始于mRNA的3'或5'端，最终获得目的基因全长cDNA的分子生物学技术[5]，已成功地应用于植物基因克隆研究。如蒋军富等用RACE技术克隆到绞股蓝SS及SE基因[4]，陈莉等用RACE技术从三七中克隆出FPS基因[6]，邢朝斌等通过RACE技术克隆出刺五加FPS基因[7]。RACE技术也可用来筛选cDNA文库，鲁国东等用RACE技术从已构建的cDNA文库中克隆了稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因[8]。RACE技术还可用来分离调控元件或选择性剪接等特殊转录物[9]。

本课题组前期采用RACE技术对绞股蓝生物合成关键酶SS、SE基因进行了克隆和序列分析。为进一步研究绞股蓝三萜皂苷生物合成途径及其可能的分子调控机制，我们继续应用RACE技术对绞股蓝FPS基因进行克隆及序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

绞股蓝采自荔浦县，种植在广西医科大学校园；大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD18-T载体、LA Taq DNA聚合酶限制性内切酶、3'-Full RACE Core Set Ver 2.0和 5'-Full RACE 试剂盒等为 Ta⁃KaRa公司产品；柱式胶回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒为中国福际公司产品；DNA寡核苷酸引物由华大基因公司合成；其他试剂均为国产分析纯产品。

1.2 绞股蓝总RNA的提取

参照蒋军富等的异硫氰酸胍法[4]。

1.3 3'RACE PCR 克隆

绞股蓝与罗汉果均为葫芦科植物，其三萜生物合成通路相关酶的基因应有较高的同源性。参照蒙姣荣[10]等有关罗汉果FPS基因的克隆及序列分析，设计扩增绞股蓝FPS的3'RACE PCR引物FPSS-1F和FPSS-3F，由华大基因公司合成。

以绞股蓝总RNA为模板，加入3'RACE Adap⁃tor，按试剂盒说明书反转录合成第一链cDNA。反应体系包括绞股蓝总RNA 1 μL、3'RACE接头1 μL、5×M-MLV缓冲液2 μL、dNTP 1 μL、RNase抑制剂 0.25 μL、反转录酶 M-MLV（RNase H-） 0.25 μL，用去除RNase的水补至总体积10 μL。42℃反转录60 min，70℃作用15 min，反应产物用于巢式PCR。以反转录得到的第一链cDNA为模板，分别以FPSS-1F、FPSS-3F与3'RACE试剂盒中的3'RACE外引物、3'RACE内引物为引物，按照3'-Full RACE Core Set Ver 2.0说明进行3'RACE外侧、内侧2轮巢式PCR扩增反应。第1轮PCR反应条件为94℃预变性 3 min，然后以 94℃变性 30 s、55退火 30 s、72℃延伸1 min行20个循环，72℃延伸10 min。以第1轮PCR产物为模板进行第2轮巢式PCR。第2轮PCR反应条件为94℃预变性3 min，然后以94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行30个循环，72℃延伸10 min。用琼脂糖电泳判断PCR产物。内侧PCR产物纯化后，与pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在X-gal/IPTG/Amp LB琼脂平板上挑取白色菌落培养，提取质粒并进行酶切及PCR鉴定，将阳性克隆送华大基因公司测序。

1.4 5'RACE PCR克隆

根据绞股蓝FPS的3'RACE测序结果，用专业引物设计软件Primer Premier 5.0设计5'RACE克隆所需特异引物。

用5'-Full RACE试剂盒对绞股蓝RNA进行去磷酸化处理、去“帽子”反应及5'RACE接头的连接，得到Ligated RNA，以Ligated RNA反转录反应液为模板，分别以FPSS-2R、FPSS-4R与5'RACE试剂盒中的外引物、内引物为引物对进行2轮巢式PCR反应。第1轮PCR反应条件为94℃预变性3 min，然后以94℃变性30 s、55退火30 s、72℃延伸1 min行20个循环，72℃延伸10 min。以第1轮PCR产物为模板进行第2轮巢式PCR。第2轮PCR反应条件为94℃预变性3 min，然后以94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行 25个循环，72℃延伸 10 min。5'RACE内侧PCR产物的纯化及克隆参照3'RACE克隆操作进行。

1.5 绞股蓝FPS基因cDNA全长序列的拼接及生物信息学分析

利用 Vector NTI Suite 6.0软件对 3'RACE 和5'RACE所得片段的测序结果进行分析和拼接。利用DNAman软件分析绞股蓝FPS基因cDNA全长序列性质，序列测定结果采用Blast进行同源性搜索。用Mega5.0软件对绞股蓝和已报道的植物FPS氨基酸序列进行相似性比对，构建系统进化树。

表1 扩增绞股蓝FPS的RACE PCR引物

2 结果

2.1 3'RACE和5'RACE克隆绞股蓝FPS基因

3'RACE和5'RACE分别得到约1000和750 bp的特异条带，参见图1。

3'RACE PCR产物重组质粒经SacⅠ/SphⅠ双酶切，得到2.6 kb的载体片段和约1 kb的目的片段；5'RACE PCR产物重组质粒经酶切后得到约750 bp的目的片段和2.6 kb的载体片段。与预测结果相符，见图2。

2.2 PCR产物测序

测序结果表明，3'RACE和5'RACE产物片段长度分别为985和714 bp（序列略）。

2.3 绞股蓝FPS基因cDNA全长核苷酸序列分析

根据3'RACE和5'RACE扩增片段测序结果，用Vector NTI Suite 6.0软件拼接得到绞股蓝FPS基因全长序列。该基因全长1288 bp，翻译起始位点为90碱基处，开放读框编码由342个氨基酸残基构成的蛋白，其等电点为5.34，相对分子质量为3.94×104。

图1 3′RACE（A）、5′RACE（B）PCR扩增FPS基因产物M：DL2000 DNA marker；1，2：3′RACE PCR产物；3，4：5′RACE PCR产物

图2 SacⅠ/SphⅠ双酶切重组质粒

氨基酸序列分析表明，绞股蓝FPS的氨基酸序列中含有非极性疏水性氨基酸（GAVLIFP）40.6%，极性中性氨基酸（WSYCMNQT）35.0%，酸性氨基酸（DE）12.3%，碱性氨基酸（KRH）11.4%。

绞股蓝的FPS基因cDNA及推衍的氨基酸序列如图3。

2.4 不同植物FPS基因序列比较及进化树分析

经NCBI Blast，发现绞股蓝FPS的氨基酸序列与已知植物FPS的同源性为91%～74%，核酸序列同源性为88%～78%。用Mega5.0软件将得到的绞股蓝FPS与植物来源的FPS的氨基酸序列（表2）进行多重比对，构建得到进化树（图4）。

3 讨论

图3 绞股蓝FPS cDNA序列及推导的氨基酸序列

RACE技术是获得cDNA全长的有效方法，广泛应用于全长基因cDNA的克隆。在RACE技术中，获得基因3'端较容易，而采用TDT加尾法[11]获得基因5'端则比较困难，往往需要根据实际情况摸索条件。我们采用TaKaRa公司的5'-Full RACE试剂盒，在对RNA进行去磷酸化、去“帽子”、加5'RACE接头后直接进行逆转录，然后进行巢式PCR，可以得到很好的5'RACE结果。但操作时间长，对RNA的完整性和稳定性要求高，因此保证RNA的质量和操作环境的清洁非常重要。

图4 不同植物FPS氨基酸序列进化树

本研究克隆的绞股蓝FPS基因与已报道的其他植物的FPS基因的编码区基本一致，FPS有2个富含天冬氨酸（DDXXDD）的氨基酸序列保守区域［LIVM］［LIVM］XDDXXDXXXXRRG 和［LIVMFY］GXXFQ［LIVM］XDD［LIVMFY］X［DN］[7,12-13]，推测的绞股蓝 FPS肽链 90～104残基（LVLDDIMDSSH⁃TRRG）和224～236残基（MGTYFQVQDDYLD）与此完全相符。绞股蓝FPS的跨膜区分析和亚细胞定位显示其无跨膜结构，定位于细胞质中，这与其他植物FPS在细胞质中合成前体蛋白后不进入其他亚细胞器，而是留在细胞质中经翻译后蛋白质的加工成为成熟蛋白质发挥催化作用而不与膜脂结合[1,13]的观点相一致。进化树分析表明绞股蓝FPS与罗汉果、黄瓜的亲缘关系最近，这证实了葫芦科植物FPS基因的同源性，与预期结果相符。同时还发现绞股蓝、罗汉果、黄瓜与苹果FPS的亲缘关系也较近，但根据NCBI采纳的植物分类表，葫芦科属于葫芦目，苹果则属于蔷薇目蔷薇科，进化上葫芦科植物与蔷薇科处于不同的分支，有可能是一个FPS基因进化的分支点。

目前利用酶表达改变萜类物质组成或量已成为改变作物及中草药植物品质的一种新手段[14]。在转基因青蒿中过量表达青蒿的FPS基因，转基因株系中青蒿素量有所提高[15]。也有研究表明，这一技术可提高在转化薄荷FPS基因的烤烟中类胡萝卜素及萜烯类香气物质的量，对提高烟叶香气品质具有促进作用[16]。综上，我们在前人的基础上克隆了绞股蓝FPS基因，并对其编码的氨基酸进行了理化性质、结构组成及生物信息学分析，以期为绞股蓝FPS的表达研究及三萜皂苷合成通路分子进化奠定基础。目前绞股蓝FPS的表达研究正在进行中。

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