正交试验优选桃红四物汤颗粒的醇提工艺研究

李培培，王桐生，吴德玲*，张 伟，马凤爱，宋 洁，左亚峰，乔金为

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；2.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学 中西医结合临床学院，安徽 合肥 230038)



正交试验优选桃红四物汤颗粒的醇提工艺研究

李培培1,2，王桐生3，吴德玲1,2*，张 伟1,2，马凤爱1,2，宋 洁1,2，左亚峰1,2，乔金为1,2

(1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230031；2.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学 中西医结合临床学院，安徽 合肥 230038)

目的：优选桃红四物汤颗粒的乙醇提取工艺。方法：采用正交试验，以芍药苷转移率及出膏率为评价指标，考察料液比浓度、提取次数、提取时间对提取工艺的影响。结果：优选出的最佳提取工艺为：加8倍量70%醇，提取3次，每次1h。结论：该提取工艺设计合理，稳定可行。

桃红四物汤；芍药苷；正交试验；提取工艺

桃红四物汤出自清代吴谦所著《医宗金鉴》[1]，由熟地、白芍、当归、川芎、桃仁、红花六味组成，具有活血祛瘀、养血调经的功效。近年来有学者对其抗炎、改善微循环、提高免疫力、促进骨折愈合、延缓肝脏纤维化进程等[2-6]药效进行了研究。由于传统水煎剂煎煮、携带、服用不方便，故将汤剂研制成颗粒剂，既克服汤剂的不足又能保持其综合疗效，但由于水提浸膏具有出膏率大、吸湿性强的特点，因此本研究采用醇提法制备颗粒所需浸膏。本研究以芍药苷转移率及出膏率为评价指标，通过正交试验探索桃红四物汤的最佳醇提工艺，为进一步对桃红四物汤的药理学作用研究和制备桃红四物汤的其他剂型提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦高效液相色谱仅(high performance liquid chromatography, HPLC)仪：包括G1312C四元梯度泵、G4212B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱、Chemstation色谱工作站；十万分之一电子天平(德国赛多利斯CP225D)；超声清洗仪(天津奥特赛恩斯AS312)；恒温水浴锅(江苏金坛市环宇科学仪器厂HH-S2系列)；真空干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂DZF-6050)。

1.2 试药

熟地黄(批号：13120101)，白芍(批号：13072001)，当归(批号：14021101)，川芎(批号：13100702)，桃仁(批号：13121001)，红花(批号：13091001)，购自安徽协和城药业有限公司，经安徽中医药大学金传山教授鉴定，熟地黄为玄参科植物地黄Rehmanniaglutinosalibosch.的干燥块根；白芍为毛茛科植物芍药PaeoniaLacifloraPall.的干燥根；当归尾伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根；川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort的干燥根茎；桃仁为蔷薇科植物桃Prunuspersica(L.)Batsch的干燥成熟种子；红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花。芍药苷标准品(批号：110736-201136，中国食品药品检定研究院)；甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；水(娃哈哈纯净水)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芍药苷含量测定

2.1.1 色谱条件： 色谱柱：SHIM-PACK VP-ODS柱(250mm×4.6mm 5μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液(12∶88)；流速：1mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：20μL。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。在上述试验条件下，芍药苷色谱峰与供试品溶液中其他色谱峰达到基线分离，见图1。

图1 桃红四物汤醇提液HPLC图谱

2.1.2 对照品溶液制备 取干燥至恒重的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为0.15mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 线性关系考察 精密称取芍药苷对照品10.16mg，于10mL容量瓶中，加色谱甲醇定容，摇匀。精密吸取0.3、0.75、1、2、3mL，分别置于10mL容量瓶中，用色谱甲醇定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，各进样20μL，按以上色谱条件测定。以进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。回归方程为y=1099234.8506x-36467.9552, r=0.999 9，芍药苷在0.6096～6.0960μg范围内与峰面积成良好线性关系。

2.1.4 供试品溶液制备 按桃红四物汤的处方配比(熟地黄、白芍、当归、川芎、桃仁、红花为12∶9∶9∶6∶9∶6)，取一倍量的饮片51g，按正交试验表提取所得醇提液，趁热过滤，合并滤液，再置于60℃恒温水浴锅上浓缩至约450mL，移至500mL容量瓶中，加相应浓度的乙醇定容至刻度。精密吸取4mL至蒸发皿中，挥干溶剂，加色谱甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过(0.45μm微孔滤膜)，取续滤液，即得。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液20μL，分别连续进样6次，按上述色谱条件测定芍药苷峰面积，芍药苷的RSD为1.71%(n=6)，表明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12h时进样20μL，按上述色谱条件测定芍药苷的峰面积，RSD为1.08%(n=5)，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.1.7 重复性试验 按“2.1.4”项下制备6份供试品溶液，精密吸取20μL，按上述色谱条件测定供试品溶液中芍药苷的含量。芍药苷的平均含量为13.535mg/g，RSD为1.004%(n=6)。表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取已知芍药苷含量的供试品溶液6份，分别加入一定量的对照品溶液，按上述色谱条件测定芍药苷的含量，结果显示芍药苷的平均回收率为100.10%，RSD为1.46%(n=6)。

2.1.9 药材中芍药苷含量测定 按2010版《中华人民共和国药典》一部白芍中含量测定项下供试品溶液的制备方法，制备白芍供试品溶液，在上述色谱条件下测定，测得白芍中芍药苷含量为32.27mg/g。

2.1.10 芍药苷转移率测定 精密吸取供试品溶液20μL进样，按上述色谱条件测定，根据标准曲线法的线性方程，由供试品峰面积计算出芍药苷的含量。芍药苷转移率=芍药苷质量/白芍药材中芍药苷质量×100%，计算芍药苷的转移率。

2.2 出膏率测定

取按正交试验表提取所得水提液，按照“2.2.2”项下方法浓缩提取液并定容至500mL，精密移取50mL置于已经干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴上蒸发，蒸干后将蒸发皿移至80℃烘箱中干燥5h，取出放置于干燥器中，冷却30min后，精密称定，再在上述温度下干燥1h，冷却，称定质量。重复操作直至连续2次称得的质量差异不超过3mg为止。按下式计算出膏率：出膏率=干膏质量/药材质量×100%。

2.3 醇提正交试验

2.3.1 因素水平安排 按照桃红四物汤组方(熟地黄、白芍、当归、川芎、桃仁、红花为12∶9∶9∶6∶9∶6)，按“2.1.4”项下方法提取，以料液比(A)、醇浓度(B)、提取次数(C)、提取时间(D)为考察因素，每个因素选取3个水平。以提取液中的芍药苷转移率和干膏率为考察指标，选用L9(34)正交表进行表头设计和安排实施试验，因素水平安排见表1，L9(34)正交试验设计详见表2。

表1 各因素水平

表2 正交试验设计与结果

2.3.2 正交试验结果 本次结果分析采用加权评分法，将芍药苷转移率、出膏率的权益系数分别取为0.5。分别把每项最高的指标定为100分，最低的定为0分。如将芍药苷转移率最佳的2号实验77.19定为100分，最低的1号试验35.02定为0分，则每升高(77.19-35.02)/100=0.4217即增加1分；同理可推得出膏率每升高(33.33-17.54)/100=0.1579即增加1分。

对正交试验结果进行直观分析和方差分析(见表2、表3)，可知，提取次数和醇浓度对提取效率影响较大，并具有显著性差异，而提取时间及料液比对其结果影响较小。因此将两者结果综合考虑得桃红四物汤的最佳醇提工艺为A2B2C3D2，即加8倍量70%醇，提取3次，每次1h。

2.3.3 验证试验 为考察上述优选提取工艺的稳定性，按该工艺条件进行重复性试验(n=3)，分别测定芍药苷的转移率及出膏率。试验结果表明，该工艺合理可行，重现性较好，验证结果见表4。

3 讨论

在测定芍药苷的含量时，结合芍药苷在酸性环境中较在碱性环境下稳定的特性，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等流动相[7,8]，结果显示，加了磷酸后的流动相，基线噪音小，芍药苷的峰型较好，且阴性对照无干扰；对比甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液后，发现甲醇-0.05%磷酸溶液条件下的色谱峰峰型较差，因此采用乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，得到的色谱图基线平稳，芍药苷所属的峰保留时间适宜且分离效果较好。

表3 方差分析

注：F0.05(2,2)=19

表4 验证试验结果

本文采用正交设计试验方法，以芍药苷转移率和出膏率作为评价指标优选桃红四物汤的醇提工艺，采用加权求和的综合评价方法，选出最佳提取工艺条件。结果表明，此工艺稳定、可行。

[1] 王康锋,邱振刚.桃红四物汤[M].北京:中国中医药出版社,2005.

[2] 任国辉,叶任高,李幼姬,等.桃红四物汤对实验性肾炎肾内血小板活化因子、血栓素B2 的影响[J].中国中西医结合杂志,1996:91-93.

[3] 金翔,时乐,汪珊珊,等.桃红四物汤不同提取部位对血虚血瘀模型大鼠微循环的影响[J].安徽医药,2010,14(4):387-389.

[4] 李树强,于涛,齐振熙.桃红四物汤对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(19):3539-3543.

[5] 熊辉,左亚杰,罗志勇,等.桃红四物汤对实验性骨折愈合过程中VEGFmRNA表达的影响[J].中医正骨,2004,16(4):8-9.

[6] 罗利琼，陈东波.桃红四物汤对肝纤维化大鼠肝组织星状细胞增殖的影响 [J].宜春学院学报,2014,36(3):69-71.

[7] 黄月纯,刘翠玲,张琼丹,等.四物汤中四种成分的含量测定研究[J].现代中药研究与实践,2010,24(4):64-67.

[8] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:96-97.

(责任编辑：魏 晓)

Optimization of Alcohol Extraction Process for Granule of Taohong Siwu Decoction by Orthogonal Test

Li Peipei1,2，Wang Tongsheng3，Wu DeLing1,2*，Zhang Wei1,2，Ma Fengai1,2，Song Jie1,2，Zuo Ya-feng1,2，Qiao Jinwei1,2

(1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230031，China；2.Anhui Key laboratory of Modern Chinese Medicines，Hefei 230031，China；3.School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China)

Objective:To optimize the alcohol extraction technology for Granule of Taohong Siwu Decoction.Methods:An orthogonal test was employed to observe the influences of the ethylalcohol volume, the ethanol concentration, extraction times and extraction time on the transfer rate of paeoniflorin, and the yield of dry extracts of Taohong Siwu Decoction. Results:The optimized extracting process was as follows: Adding 8 times of the mount of 70% ethylalcohol, extracting 3 times, and extracting for 1h per time. Conclusion:The optimized process can be used for extracting active components from Taohong Siwu Decoction because of its being stable, reasonable, and feasible.

Taohong Siwu Decoction；Paeoniflorin；Orthogonal Test；Extracting Technology

2014-07-25

省级大学生创新创业训练计划项目(AH201310369054)

李培培(1989-)，女，安徽中医药大学硕士研究生，研究方向为中药质量标准规范化研究。

吴德玲(1973-)，男，安徽中医药大学教授，研究方向为中药活性成分研究、中药质量评价研究和中药新药的研究与开发。

R284

A

1673-2197(2014)23-0019-03