川芎配方颗粒提取工艺及咖啡酸、阿魏酸含量测定

罗 旭，胡昌江，吴文辉，王 虎，冯 健

(四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川 成都 611930)



川芎配方颗粒提取工艺及咖啡酸、阿魏酸含量测定

罗 旭，胡昌江*，吴文辉，王 虎，冯 健

(四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川 成都 611930)

目的：优选川芎配方颗粒提取工艺,建立咖啡酸和阿魏酸含量的测定方法。方法：以正交试验优选川芎配方颗粒的提取工艺，采用HPLC建立其咖啡酸、阿魏酸含量测定方法。结果：优选出川芎配方颗粒提取工艺为10倍量水, 浸泡0.5h, 每次1h，提取3次；咖啡酸和阿魏酸HPLC测定方法为：流动相：乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；检测波长：323nm；流速：1.0mL/min，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000。结论：该提取工艺有效成分提取效率高，质量控制方法稳定可行, 可作为川芎配方颗粒生产和质量控制的科学依据。

川芎配方颗粒；咖啡酸；阿魏酸；含量测定

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎[1]，辛、温、归肝、胆、心包经，活血行气、祛风止痛，用于治疗胸痹心痛、胸胁刺痛、跌扑肿痛、月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、头痛、风湿痹痛等。川芎主要含挥发油、生物碱、有机酚酸及酯类、多糖类等多种化学成分[2-4]。其中挥发油和有机酚酸及酯类是其主要的有效成分，具有扩张血管、降血压、抗心肌缺血、抗脑缺血、镇静、镇痛等多种药理作用[5-7]。川芎饮片临床煎煮均要求后下以保证疗效，而川芎配方颗粒是在饮片煎煮的原则指导下，经现代制药工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成的单味颗粒剂。故川芎配方颗粒的现代提取工艺和质量控制标准和方法亟待建立。本实验以咖啡酸、阿魏酸的含量并结合干浸膏得率作为主要考察指标，优选出川芎配方颗粒的最佳提取工艺条件，为川芎配方颗粒的生产工艺提供依据，并初步建立川芎配方颗粒的咖啡酸、阿魏酸含量测定方法，为其质量评价提供科学依据。

1 仪器与材料

美国Waters2695-2996高效液相色谱仪,Empower色谱工作站；电子天平：BP211D电子天平(d=0.1mg/0.01mg,max=210g/80g，Sautoris，德国)；KQ5200DB型超声波清洗器(昆山市仪器有限公司),咖啡酸对照品( 批号：110885-200102，中国食品药品检定研究院)；阿魏酸对照品(批号：110773-200611；中国食品药品检定研究院)；色谱级甲醇、乙腈(迪马公司)；水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。川芎和川芎配方颗粒均由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供(批号：1303102、1302090、1304306、1312091、1312092、1312093)。

2 方法与结果

2.1 咖啡酸、阿魏酸含量测定方法建立

2.1.1 检测波长选择 实验分别对咖啡酸、阿魏酸对照品溶液在200～400nm波长进行扫描，均在323nm处咖啡酸、阿魏酸有最大吸收且灵敏度最高，因此确定咖啡酸、阿魏酸的检测波长为323nm。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取咖啡酸、阿魏酸对照品适量，加70%甲醇制成每1mL含咖啡酸20μg、含阿魏酸30μg的混合溶液，即得。

2.1.3 提取溶剂考察 取本品颗粒(批号1312091)4份，每份0.5g,研细，精密称定，置100mL锥形瓶中，分别精密加入不同溶剂甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇25mL，称重，加热回流30min，取出，放冷，再次称定重量，用相应溶剂补足减失重量，滤过，取续滤液进样。测定咖啡酸、阿魏酸总含量。见表1。

表1 不同溶剂考察结果 (n=2)

结果表明，提取溶剂为70%甲醇的咖啡酸、阿魏酸总含量最高，且杂质峰少无干扰，因此确定提取溶剂为70%甲醇。

2.1.4 提取方法考察 取本品颗粒(批号1312091)2份，每份0.5g,研细，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称重，分别超声(功率200W，频率25kHz)和回流30min，取出，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液进样。测定超声、回流所得咖啡酸、阿魏酸总含量分别为1.38、 1.45mg/g，结果表明，回流提取比超声提取总含量更高，所以确定提取方法为回流提取法。

2.1.5 提取时间考察 取本品颗粒(批号080601)4份，每份0.5g,研细，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称重，分别加热回流10、20、30、40min，取出，放冷，再次称定重量，用70%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液进样。测定10、20、30、40min提取时间下咖啡酸、阿魏酸总含量分别为1.37、1.42、 1.46、1.46mg/g，故确定回流提取时间为30min。

从以上可知，确定供试品制备方法：取本品颗粒0.5g，研细，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称重，加热回流30min，取出，放冷，再次称定重量，用70%甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液，即得。

2.1.6 阴性样品溶液制备 取本品缺川芎的阴性样品0.5g，照供试品的制备方法制成阴性样品溶液。

2.1.7 色谱条件 色谱柱： DiamonsiL ODS-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(14∶86)；检测波长：323nm；流速：1.0mL/min，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000。

在此条件下，川芎配方颗粒中咖啡酸、阿魏酸的分离度好，理论塔板数较高，峰形对称性好。结果见图1。

图1 川芎配方颗粒HPLC图谱

2.1.8 方法学考察

(1)标准曲线。分别精密吸取上述咖啡酸、阿魏酸混合对照品溶液(咖啡酸0.0276mg/mL、阿魏酸0.0392mg/mL)1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以咖啡酸、阿魏酸的峰面积值(Y)为纵坐标，以咖啡酸、阿魏酸的进样量(X)为横坐标，计算得咖啡酸回归方程为Y=5×106X -34640, r2= 0.999 2，阿魏酸标准曲线方程为Y=5×106X -64562，r2=0.999 3，咖啡酸在0.0276～0.552μg范围内，阿魏酸在0.0392～0.784μg范围内，对照品峰面积与进样量有良好的线性关系。

(2)精密度试验。精密吸取上述对照品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积。计算得RSD%为0.96(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

(3)重复性试验。称取同一批样品(批号1312091)，精密称定，按上述测定方法制备样品供试品溶液，共6份，测定峰面积，RSD%为0.79(n=6)，结果表明该方法重现性良好。

(4)稳定性试验。精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μL, 置室温下放置，分别于0、2、4、6、8、10h进样，按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸的峰面积，计算得对照品RSD%为0.72 (n=6)，供试品RSD% 为1.04 (n=6)，结果表明对照品溶液和供试品溶液在10h内稳定性良好。

(5)加样回收试验。取已知含量的样品(批号1312091,咖啡酸含量为0.501mg/g，阿魏酸为1.01mg/g)0.25g，精密称定，共6份，分别精密加入咖啡酸、阿魏酸适量对照品溶液，按正文供试品溶液制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，计算回收率。咖啡酸平均回收率为99.44%，RSD为1.90%，阿魏酸平均回收率为99.03%，RSD为2.13%，样品加样回收率在95%～105%之间。表明样品回收率良好。结果见表2、表3。

表2 咖啡酸回收率试验结果

表3 阿魏酸回收率试验结果

(6)样品测定。分别取不同批号的川芎配方颗粒约0.5g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，分别进样10μL，按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸峰面积，计算咖啡酸、阿魏酸总含量，分别为1.33、1.28、1.41、1.35 、1.26、1.37 mg/g,6批川芎配方颗粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的总含量为1.26mg～1.41mg，故暂定本品每1g配方颗粒含咖啡酸(C9H8O4)、阿魏酸(C21H18O12)总量不得少于1.0mg。

2.2 川芎配方颗粒剂提取制备工艺条件筛选

2.2.1 正交试验 传统中药汤剂多用水煎煮, 目前国内已生产的配方颗粒的提取溶剂均为水, 因此本文选用水作为提取溶剂。根据影响的因素，固定浸泡的时间为0.5h,选择加水量、提取时间、提取次数为考察因素。以咖啡酸、阿魏酸含量和总出膏率为主要考察指标, 对川芎配方颗粒剂的提取工艺进行正交试验, L9(34)正交试验安排见表4，以下部分的HPLC法测定各工艺下干膏率和制得浸膏中咖啡酸、阿魏酸含量, 结果见表5。

综合评分的计算方法为：以得率最大者为100%，将其它组别结果换算为最高值的百分比，再以咖啡酸、阿魏酸、出膏率含量权重分别占35%、35%、30%的比例进行相加后所得的值。

表4 因素水平表

表5 正交试验

表6 方差分析结果

对表5直观分析表明,各影响效果依次为C>A>B；因此因素C(提取次数)有显著性影响。加水量和提取时间影响不明显。经表5、表6分析得出的最佳提取工艺条件为A3B2C3,即加12倍量水，浸泡0.5h，每次1h,提取3次。从大生产节约成本因素考虑，优化工艺方案为A2B2C3,即加10倍量水，浸泡0.5h，每次1h，提取3次。

2.2.2 实验验证 为确定工艺的优劣和稳定性，以A2B2C3组合进行了3批验证试验，试验证明，3批该工艺下的综合评分达到96%以上，证明该工艺稳定可靠，合理可行。

2.3 配方颗粒制备

按上述确定的工艺提取川芎饮片,合并煎液，浓缩和干燥制成干浸膏粉, 粉碎,加入适量辅料, 混匀,制粒,整粒，即得川芎配方颗粒。

分别取不同批号的川芎配方颗粒约0.5g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，分别进样10μL，按上述色谱条件测定咖啡酸、阿魏酸峰面积，计算咖啡酸、阿魏酸总含量，分别为1.33、1.28、1.41、1.35、1.26、1.37mg/g,6批川芎配方颗粒中每1g咖啡酸、阿魏酸的总含量为1.26mg～1.41mg，故暂定本品每1g配方颗粒含咖啡酸(C9H8O4)和阿魏酸(C21H18O12)总量不得少于1.0mg。

3 讨论

川芎配方颗粒的水提工艺直接关系到配方颗粒的质量，以总干膏量和咖啡酸、阿魏酸的含量作为衡量指标, 初步评价工艺的提取效果。提取工艺研究表明, 煎煮时间和加水量对工艺的影响较小，为次要因素, 而煎煮次数对咖啡酸、阿魏酸的含量和出膏率有显著的影响, 是该饮片提取工艺的重要因素。综合分析比较最终确定提取工艺为加10倍量水、浸泡0.5h、煎煮1h、提取3次,再次验证表明工艺及结果合理比较稳定。

由于川芎饮片中含有挥发油成分，但在煎煮过程中损失掉了。为了保持与传统中药汤剂煎煮一致的原则，故未采取单独提取挥发油再加入到颗粒中的方法。

该实验用《中国药典》2010年版一部川芎药材的流动相甲醇-1%冰醋酸(70∶30)，经证明阿魏酸的分离度好，对称性高，保留时间适中，而咖啡酸对称性不好,且基线高，易出现拖尾，达不到分离要求，综合考虑阿魏酸和咖啡酸，故未采用药典2010年版的流动相。本实验采用流动相乙腈-0.1%磷酸(14∶86)，实验证明咖啡酸、阿魏酸对称性分离度好，理论塔板数高，达到实验的要求。

由于条件有限, 川芎配方颗粒样品数量较少, 有待在进一步试验中积累数据, 对咖啡酸、阿魏酸含量制订一个限量范围, 使其质量更加稳定可靠。通过本实验，建立HPLC测定川芎配方颗粒中咖啡酸、阿魏酸含量方法，各项研究符合含量测定方法的要求，可有效控制川芎配方颗粒质量，进一步保证临床疗效。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:26.

[2] 李秋怡,干国平,刘焱文，等.川芎的化学成分研究及药理进展[J].时珍国医国药,2006，17(7)：1298-1299.

[3] 北京制药工业研究所.川芎成分的化学研究[J].药学通报,1980,15(10):471.

[4] 王文祥,顾明,蒋小岗,等.川芎化学成分的研究[J].中草药,2002,33(1): 4-5.

[5] 王义雄,高宣亮,王普善,等.川芎中的另一类活性成分[J].中草药,1985,16(11):17.

[6] 张宝林, 虎佩兰, 徐正谷,等.川芍红花注射液对百日咳菌液所致兔脑水肿的作用[J].中西医结合杂志，1988，8(9)：544.

[7] 刘众, 史荫绵, 陈达仁，等.川芎对急性实验性脑缺血大白兔血浆和脑脊液中强啡肚A1-13含量的影响[J].中西医结合杂志,1990,10(3)：380.

(责任编辑：魏 晓)

Extraction Process and Content Determination of Coffee Acid and FeruLic Acid in Chuanxiong FormuLa Granule

Luo Xu, Hu Changjiang, Wu Wenhui, Wang Hu, Feng Jian

(Neo-GreenPharmaceuticaL Co.Ltd., Chengdu 611930，China)

Objective:Optimization of extraction process of Chuanxiong formula granule, establish Coffee acid and method to determine the content of ferulic acid. Methods:The optimum extraction process of Chuanxiong formula granule by orthogonal test, using HPLC to establish a method for determination of the Coffee acid, ferulic acid. Results:To optimize the extraction process of Chuanxiong formula granule was 10 times the volume of water, soak 0.5h, 1h each time, extracting 3 times; for the determination of Coffee acid and ferulic acid in mobile phase acetonitrile HPLC: -0.1% phosphate (14:86); the detection wavelength: 323nm; flow rate: 1.0mL/min, according to the number of board of ferulic acid peak calculation should not be less than 4 000. Conclusion:The effective components of the extraction efficiency is high, the quality control method is stable and feasible, and can be used as a scientific basis for Chuanxiong formula granule production and quality control.

Chuanxiong Formula Granule；Coffee Acid；Ferulic acid；Content Determination

2014-08-07

罗旭(1980-)，男，四川新绿色药业科技发展股份有限公司技术员，研究方向为中药配方颗粒质量标准研究。

胡昌江(1952-)，男，四川新绿色药业科技发展股份有限公司教授、博士生导师，研究方向为中药炮制与临床。E-mail:hhccjj@hotmaiL.com。

R284

A

1673-2197(2014)23-0014-03