CYP2C9、VKORC1基因多态性对华法令抗凝治疗维持剂量的影响*

倪立，初亚男，张婕妤，周国华

南京军区南京总医院药理科，南京 210002

CYP2C9、VKORC1基因多态性对华法令抗凝治疗维持剂量的影响*

倪立，初亚男，张婕妤，周国华

南京军区南京总医院药理科，南京 210002

目的：研究细胞色素P450 2C9基因（CYP2C9）和维生素K环氧化物还原酶复合物1基因（VKORC1）在华法令抗凝治疗患者的多态性分布，并探讨其对抗凝剂量的影响。方法：收集74例服用华法令抗凝治疗病人的外周血，测定其凝血酶原时间国际标准化比值（INR）和CYP2C9、VKORC1基因类型，探讨基因多态性的分布特点，以及华法令维持剂量与基因多态性的关系。结果：CYP2C9基因分布主要为野生型，突变型较少，抗凝治疗的维持剂量野生型组与突变组无明显差别。VKORC1基因型的分布AA型为主，AG型较少，GG型未见，抗凝治疗的维持剂量AG组明显高于AA组。结论：CYP2C9、VKORC1基因在中国汉族人群中具有遗传多态性，VKORC1基因的多态性在华法令抗凝治疗中具有显著意义。

CYP2C9；VKORC1；基因多态性；华法令；INR

1 资料和方法

华法令是一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶栓的双重作用，但由于华法令抗凝治疗窗窄，使用不当容易引起出血或栓塞。华法令临床使用的稳定剂量常常受到饮食、疾病状态、联合用药及基因等因素的影响，其中与基因相关因素的影响近年来研究较多，目前受关注较多的基因中有细胞色素P450 2C9（CYP2C9）和维生素K环氧化物还原酶复合物1（VKORC1）[1-2]。了解其分布特点及对华法令维持剂量的影响，有助于华法令个体化合理使用。

1.1 研究对象

收集2013年～2014年在南京军区南京总医院就诊的因各种原因服用华法令抗凝的患者74例，其中男性52例，女性22例，年龄20～78岁，肝肾功能正常。在临床医师指导下服用华法令，检测凝血酶原时间国际标准化比值（INR），并根据测定结果调整用药剂量至抗凝维持剂量。同时测定CYP2C9、VKORC1的基因类型。

1.2 试验方法

1.2.1 样本采集及处理在患者知情同意的前提下，收集外周血5 mL（EDTA-Na2抗凝）。

1.2.2 凝血酶原时间国际标准化比值（INR）测定采血后30 min内3000 r·min-1离心15 min，检测INR。仪器为自动凝血仪，由本院检验科测定。

1.2.3 基因测序

主要试剂Wizard®基因组DNA提取试剂盒（Promega公司）；TaqTMDNA聚合酶试剂盒（TaKaRa公司）；引物（英骏合成）；ProMark Gold Q96试剂盒（QIAGEN公司）。

主要仪器基因扩增仪（朗基）；PyroMark Q24真空工作站（QIAGEN公司）。

PCR扩增引物序列见表1。其中一条引物5’经生物素（Biotin）修饰。采用50 μL PCR体系：10× PCR buffer 5 μL、MgCl23 μL、dNTP Mixture 4 μL、10 μmol·L-1正反引物各2 μL、蒸馏水32.15 μL、Taq酶0.25 μL、基因组DNA 2.5 μL。反应条件：CYP2C9*2和CYP2C9*3位点使用的PCR程序：94℃5 min，35 cycles（94℃30 s、55℃30 s、72℃30 s），72℃7 min。VKORC1位点使用的PCR程序：94℃5 min，35 cycles（94℃30 s、65℃30 s、72℃30 s），72℃7 min。

焦磷酸测序使用PyroMark Q24真空工作站进行单链制备和焦磷酸测序过程。退火引物序列见表2。退火程序：80℃30 s，室温冷却至少5 min。

表1 目的基因扩增引物序列

表2 目的基因退火引物序列

2 结果

2.1 基因型分布

在进行CYP2C9基因型测定时，检测了*2*3等位基因的突变情况，其中*2突变杂合型6例，*3突变型3例，同时含*2*3突变1例，因为同是CYP2C9基因突变表现，所以合并统计。在观察的74例患者中CYP2C9野生型64例，CYP2C9*2或*3突变型10例。VKORC1基因型及等位基因检测结果，在观察的74例患者中VKORC1野生型（AA）61例，VKORC1突变AG型13例，VKORC1突变GG型0例，见表3。

表3 不同种族基因频率分布情况

由于不同种族的基因表现存在着多态性，所以将研究结果与高加索人[1，3-4]及其它汉族人群研究结果[1，5]进行了对比，结果见表3。从表3可以看出，汉族人的CYP2C9基因分布与高加索人相似，大多数人为野生型；但VKORC1基因型的分布情况不同，汉族人以AA型为主，AG型较少，GG型罕见，而高加索人以AG为主，AA型较少。

2.2 基因多态性与剂量的关系

分别以CYP2C9和VKORC1基因多态性为依据进行分组，以INR为抗凝治疗的疗效指标，对各组华法令维持剂量进行统计，并进行组间t检验，各组病数、抗凝疗效（INR）和维持剂量见表4。从统计结果看出，CYP2C9两组间临床维持剂量没有明显差异。VKORC1中两组比较，在AG组INR值低于AA组的情况下，华法令的维持剂量AG组仍明显高于AA组，两组间均值进行t检验，t=2.5182，2.030（t0.05）<2.5182（t）<2.724（t0.01），因此0.01

表4 基因多态性对华法令抗凝治疗的影响（±s）

表4 基因多态性对华法令抗凝治疗的影响（±s）

*与VKORC1野生型（AA）型组相比，有显著差异，0.01＆lt;P<0.05。

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3 讨论

华法令是目前临床广泛使用的口服抗凝药，研究表明,不同患者的剂量可以相差20倍，造成临床维持剂量差异的原因有多种，其中遗传因素是引起个体差异的主要原因之一。近年来的研究表明，CYP2C9和VKORC1是对华法令剂量具有显著影响的两个基因组，也是华法令疗效研究中备受关注较多的两个基因组[1-2]。比较了CYP2C9和VKORC1基因多态性分布在不同种族之间的表现，在高加索人中CYP2C9基因频率分布以野生型为主，突变型少见[1，3-4]。在本研究收集的74例病例中，CYP2C9野生型64例，分布频率为86.5%，突变型10例，分布频率为13.5%，其它以汉族为目标的研究中CYP2C9基因频率分布也相似[1，5]。VKORC1基因在高加索人频率分布以AG+GG型为主（85.8%），AA型相对较少（14.2%），而汉族人VKORC1基因多态性分布以AA为多[1，5]。在本研究收集的74例病例中，AA型61例，分布频率为82.4%，AG型13例，分布频率为17.6%，GG型0例。其它以汉族为目标的研究中AA型分布频率为82.1%，AG+GG型分布频率为17.9%[1，5]，与本研究结果相近。从上述研究看出，汉族人与高加索人在CYP2C9基因多态性分布频率上没有显著差异，但在VKORC1基因多态性分布频率上汉族人与高加索人有明显不同，汉族人群中以野生型AA为主（82.2%），而高加索人以突变型AG+GG为主（85.8%）。

当国际标准化比值（INR）较低时，血栓栓塞复发风险上升，但当INR超过4 mg·d-1时出血的风险明显增加，INR值直接决定患者华法令的使用剂量的大小。不同种族间华法令剂量有明显差异，黄种人平均稳定剂量约为3．0 mg·d-1，白人约为4．5 mg·d-1，黑人约为5．7 mg·d-1[6-7]，亚洲华人华法令剂量低于高加索人，汉族人与高加索人在CYP2C9基因多态性分布频率上没有显著差异。本研究收集的病例为本院医生根据患者病情的需要自主决定华法令剂量，并根据INR值调整后给予稳定剂量。对患者华法令的用药情况按不同基因型进行分类统计，从结果可以看到以CYP2C9基因型进行分类，野生型与突变型用药剂量无明显差异，这一结果与文献报道相似，从中可看出CYP2C9基因多态性并不能解释不同种族间华法令剂量的个体差异，也有可能是CYP2C9基因突变位点较多，各个突变位点对华法令剂量的影响不同，对此有待进一步研究。以VKORC1基因型进行分类，在本研究中可以看出，未突变的AA型与突变的AG型用药剂量有明显差异，在INR值低于AA基因组的情况下AG型患者的用药剂量明显较高，两组间差异有统计学意义，含VKORC1突变型基因的人群达到临床所需的抗凝疗效所用的华法令剂量明显高于非突变型人群，提示含VKORC1突变型基因的患者在使用华法令抗凝时应适当增加剂量。中国人群中含VKORC1突变型基因（17%）的比率低于白人（85%），这可能是导致中国人群华法令平均稳定剂量低于白种人的主要原因。

华法令治疗窗较窄，抗凝维持剂量受多种因素的影响，其中基因多态性是导致个体差异最主要的原因，基因导向的给药方式与传统固定剂量的治疗方案相比，可有效缩短达到稳定剂量的时间，减少因剂量原因引起的出血或栓塞风险，为临床更安全有效用药提供了依据。

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[2] TakeuchiF,MeginnisR,BourgeoisS,etal．A genome-wideassociationstudyconfirmsVKORC1, CYP2C9,and CYP4F2 as principal genetic determinants of warfarin dose[J]．PLoS Genet,2009,5(3): el000433．

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Effects of CYP2C9 and VKORC1 Genetic Polymorphisms on Warfarin Maintenance Dosage of Anticoagulation*

NI li,CHU Ya-nan,ZHANG Jie-yu,ZHOU Guo-hua
Department of Pharmacology,General Hospital of Nanjing Military Area,Nanjing 210002,China

Objective：To investigate the polymorphism distribution and characteristics of cytochromeP450 2C9(CYP2C9)and vitamin K epoxide reductase complex(VKORC1)in Han population,as well as the relationship between each polymorphism and warfarin anticoagulation dose．Methods：Seventy-four patients in Han population with stable anticoagulation taking warfarin were recruited．TheirCYP2C9andVKORC1genotypes were tested by pyrosequencing,and their international normalized ratios(INR)were obtained．Results：Most of the patients in our study had wild typeCYP2C9,with similar warfarin doseage to those of mutated type．ForVKORC1genotype,most patients with wild type AA had lower warfarin doseage than those with the mutated variant．Conclusion：The genetic polymorphisms ofCYP2C9andVKORC1present in Han population,and theVKORC1genotypes could affect individualized warfarin dose in anticoagulation．

CYP2C9;VKORC1;Polymorphism;Warfarin;INR

R969.3

A

1673-7806（2014）06-492-03

江苏省药学会-奥赛康临床药学基金项目（201212）

倪立，女，副主任药师 E-mail:jqzynl@163.com

2014-07-27

2014-08-15