反相高效液相色谱法测定保婴镇惊丸中大黄素和大黄酚含量

巩长芹

（山东省临沂市食品药品检验检测中心,山东 临沂 276001）

保婴镇惊丸收载于部颁标准第八册,由大黄、甘草、朱砂组方,原质量标准中只有性状和检查项目,而无含量测定项,不能有效地控制该产品的质量。该处方中大黄为主药,大黄素和大黄酚为大黄的主要活性成分。本研究中选择测定大黄药材中大黄素和大黄酚的含量作为本品质控定量指标,建立了准确、简便、可靠的大黄素和大黄酚的分析方法,能有效控制该产品的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent1260型高效液相色谱仪（配在线脱气机、G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1315DDAD检测器,美国 Agilent公司）；XS205DU型电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）。大黄素对照品（供含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号为110756-200110）,大黄酚对照品（供含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号为110796-201017,含量以 99.6%计）；保婴镇惊丸（济南宏济堂制药有限责任公司,批号为 1012001,1012002,1012003）；甲醇为色谱纯,水为纯化水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱（250mm ×4.6mm,5μm）；流动相:甲醇-0.1% 磷酸（85∶15）；流速:1.0mL/min；柱温:35℃；进样量:5μL。大黄素和大黄酚的分离度分别为3.4和9.5,理论板数分别为14510和18265。

2.2 溶液制备

精密称取大黄素对照品 4.12mg、大黄酚对照品9.10mg,置100mL容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。取本品适量,研细,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定质量,置水浴中回流30 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,滤过,取续滤液10 mL,蒸干,加水20mL使溶解,加盐酸2mL,三氯甲烷20mL,置水浴中回流1 h,取出,放冷,取三氯甲烷液,水液用三氯甲烷提取3次,每次15mL,合并三氯甲烷液,蒸干,用甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得供试品溶液。按保婴镇惊丸处方比例精密称取全方中除大黄以外的其他药材,按供试品溶液制备方法制备,即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

干扰试验:取对照品溶液、供试品溶液、缺大黄的阴性对照品溶液,按拟订色谱条件进样分析。结果,在供试品溶液色谱图中,分别有与对照品大黄素、大黄酚保留时间一致的特征峰,保留时间分别为6.26,8.44min,阴性对照品溶液无此特征峰,表明阴性样品对所测组分无干扰,见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:取 2.2 项下的对照品溶液 1,2,4,6,8,10,12,15μL,按拟订色谱条件分别自动进样,记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X,μg）为横坐标进行线性回归,得大黄素、大黄酚回归方程 Y素=2880.116 X-0.1906（r=0.999999）,Y酚=4244.042 X＋2.3637（r=0.999998）。结果表明,大黄素、大黄酚进样量分别在 0.0412～0.6180μg和 0.09060～1.3890μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取2.2项下的对照品溶液,按拟订色谱条件自动重复进样6次,进样量5μL,记录色谱图。结果大黄素、大黄酚峰面积平均值分别为593和1927,RSD分别为0.09%和0.07%(n=6),表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品（批号为1012002）溶液,室温下放置,分别于配制后 0,2,4,6,8,10,12,24 h 时各进样 1 次,进样量5μL,记录色谱图。结果大黄素、大黄酚峰面积平均值分别为512 和 1257,RSD 分别为 0.11% 和 0.05%(n=8),表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:分别精密称取同一批（批号为1012002）样品6份,依法制备供试品溶液,按拟订色谱条件分别进样5μL,记录大黄素、大黄酚的峰面积。结果大黄素、大黄酚平均含量分别为0.890mg/g和 1.478mg/g,RSD 分别为 0.18% 和 0.14%(n =6),表明方法重复性良好。

加样回收试验:取已知含量的同一批（批号为1012002）保婴镇惊丸6份,每份0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别精密加入大黄素、大黄酚对照品溶液10 mL。依法制备供试品溶液,按拟订色谱条件,分别进样5μL测定。结果见表1。

表1 大黄素、大黄酚加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取3批样品,依法制备供试品溶液,按拟订色谱条件,分别进样5μL,记录大黄素、大黄酚峰面积,按外标法计算含量。结果批号为1012001,1012002,1012003的样品中大黄素和大黄酚的含量分别为 0.912,0.890,0.899mg/g 和 1.489,1.478,1.502mg/g。

3 讨论

保婴镇惊丸具有清热、镇惊、导滞的功效,主治小儿急热惊风、实热目赤、口疮、便燥、小便赤黄。大黄具有泻热毒、破积滞、行瘀血之功效,治实热便秘、谵语发托、食积痞满、痢疾初起、里急后重等症,为方中君药。为了用药安全,必须控制其质量,建立其标准。

蒽醌类成分在254 nm波长处有最大吸收[1-5],故检测波长选择254 nm。参考2010年版《中国药典（一部）》中大黄药材含量测定的流动相[1-3],结果以甲醇-0.1% 磷酸溶液（85∶15）为流动相,各成分峰形好,分离度高,阴性无干扰。且此方法简便、准确,为保婴镇惊丸质量标准的制订提供了科学依据。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京:中国医药科技出版社,2010:22.

[2]张火旺.高效液相色谱法测定清淋颗粒中大黄素和大黄酚的含量[J].中国药业,2012,21（19）:34-35.

[3]吴 袭.高效液相色谱法测定通经甘露丸中大黄酸、大黄素及大黄酚的含量[J].中国药业,2010,19（13）:32-33.

[4]陈玉敏,曹 红,邢俊波,等.HPLC法测定烂积丸中大黄素与大黄酚的含量[J].中国药事,2010,24（1）:68-69.

[5]华小东,王智华,王菊美,等.HPLC同时测定黄疸茵陈颗粒中大黄素、大黄酸、大黄酚的含量[J].中成药,2002,24（5）:340-341.