高效液相色谱法测定注射用头孢曲松钠含量的不确定度评定

董超琪,袁华峰,屈 蓉

（江苏省泰州市食品药品检验所,江苏 泰州 225300）

一切测量结果都不可避免地存在不确定度,《测量不确定度评定与表示》将“测量不确定度”定义为“表征合理地赋予被测量之值的分散性,与测量结果相关联的参数”[1]。不确定度越小,测量结果的质量越高,使用价值越大。依法设置的各级（食品）药品检验所对外出具的检验检测数据是判定药品质量的重要依据,特别是当这些数据处于标准规定的边缘时,引入不确定度参数对于评估定量分析方法的可靠性和测量结果的准确性就显得尤为重要。笔者根据标准中的有关规定[1],对采用高效液相色谱（HPLC）法测定注射用头孢曲松钠含量的测量不确定度进行了分析,以期找出影响不确定度的因素,并对其不确定度进行了测量和评估。

1 仪器与试药

Waters2695-2996型高效液相色谱仪；梅特勒 AG135型电子天平（十万分之一）。头孢曲松对照品（中国药品生物制品检定所,含量为83.7%,批号为130480-200903）；注射用头孢曲松钠（上海新亚药业有限公司,规格为每支1.0 g,批号为120923）；乙腈为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 溶液制备

精密称取头孢曲松对照品 20.37 mg和 20.22 mg,分别置100 mL容量瓶中,加流动相适量使溶解并定容至刻度,摇匀,即得对照品溶液A和B。精密称取平均装量项下注射用头孢曲松钠24.33 mg和 24.81 mg,分别置 100 mL 容量瓶中,加流动相适量使溶解并定容至刻度,摇匀,即得供试品溶液A和B。

2.1.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:岛津 C18柱（150 mm ×4.6 mm,5 μm）；流动相:0.02mol/L 正辛胺溶液-乙腈（73∶27）；检测波长:254 nm；柱温:30℃；流速:1.0mL/min。理论板数按头孢曲松峰计算为5600。

2.1.3 测定方法

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算含量。

2.2 不确定度评估

2.2.1 建立数学模型

根据测定过程,依据以下公式计算含量:

式中,Q为标示量的百分含量（%）,A样为样品溶液峰面积,A对为对照品溶液峰面积,V样为样品稀释倍数,V对为对照品稀释倍数,为平均装量,W样为样品称取量,W对为对照品称取量,W标为标示量,S对为对照品纯度。

2.2.2 不确定度来源

根据含量计算公式,分析每一测定步骤的影响因素,绘制因果关系图,见图1。

2.2.3 分析并计算不确定度分量

1）对照品纯度的相对不确定度 urel（S对）

属B类不确定度。头孢曲松对照品纯度为83.7%,使用说明未给出不确定度,假定[2]分布区间为±0.05%,按矩形分布换算:

2）对照品称量的相对不确定度urel（W对）

来源主要有以下2处,均属B类不确定度。

天平检定的不确定度:潜在有“灵敏度”和“示值误差”2个主要分量,由于减重称量是在同一台天平且很窄的范围内进行,灵敏度带来的不确定度可以忽略不计（即天平量程范围内的系数漂移将被抵消）。天平检定证书给出的最大允差为±0.05 mg,在95%置信概率时按正态分布分别评定其相对不确定度,0.05/1.96/20.37 = 1.25 × 10-3；0.05/1.96/20.22 = 1.26 × 10-3。

称量的重复性:检定证书给出的天平重复性误差为±0.02mg,在95%置信概率时按正态分布分别评定其相对不确定度,0.02/1.96/20.37 = 5.01 × 10-4；0.02/1.96/20.22 = 5.05 × 10-4。

减重称量是由相对独立的2次称量所得,每次称量都会受到天平检定和随机变化（重复性）带来的不确定度影响,因此:

图1 因果关系图

3）对照品溶液稀释的相对不确定度 urel（V对）

玻璃量器体积检定:属B类不确定度。由《常用玻璃量器检定规程》（JJG196-2006）查得,A级100 mL容量瓶的允差为±0.10 mL,按三角分布[3],相对不确定度为 0.10//100 =4.08 × 10-4。

温度:属B类不确定度,由量瓶体积校准时与试验温度不一致引入的不确定度。量瓶的体积是在20℃下进行校准的,试验温度在±3℃范围内变动,由于溶液的体积膨胀系数明显大于量瓶容积的膨胀,故可只考虑前者的影响。水的体积膨胀系数为2.1×10-4,按矩形分布,则相对不确定度为 100×2.1×10-4×3//100 = 3.60 × 10-4。

由于采取2份对照品平行试验,则

4）对照品溶液色谱峰面积的相对不确定度 urel（A对）

主要由峰面积重复性与仪器环境、进样体积等其他因素的不确定度共同引起。峰面积重复性属A类不确定度,可通过重复进样测定而得；仪器环境、进样体积等其他因素引起的不确定度属B

6）样品溶液稀释的相对不确定度 urel（V样）

玻璃量器体积检定:参照3）对照品溶液项下方法分析,A级100 mL容量瓶的允差为±0.10 mL,按三角分布[3],则相对不确定度为 0.10//100=4.08 ×10-4。

温度:分析参照3）对照品溶液项下方法分析项,按矩形分布,则相对不确定度为 100×2.1×10-4×3//100=3.60 × 10-4。

由于采取2份样品平行试验,则

类不确定度,由于对照品和供试品采用相同的进样体积,且峰面积是在相同条件下测得,故此项可以忽略不计。取对照品溶液A重复测量3次,得到峰面积 S值为21478,平均峰面积为12585311,则 urel（A对1） =21478//12585311 =9.85 ×10-4；取对照品溶液A重复测量3次,得到峰面积 S值为51216,平均峰面积为 12368120,则 urel（A对2）=51216//12368120 =2.39 ×10-3。因此,

5）样品称量的相对不确定度 urel（W样）

天平检定的不确定度:参照2）对照品称量项下方法分析,平均装量及 2份样品的相对不确定度分量依次为,0.05/1.96/1102.5 = 2.31 × 10-5；0.05/1.96/24.33 = 1.05 × 10-3；0.05/1.96/24.81 = 1.03 × 10-3。

称量的重复性:参照2）对照品称量项下方法分析,平均装量及 2 份样品的相对不确定度分量依次为,0.02/1.96/1102.5 =9.26 × 10-6； 0.02/1.96/24.33 = 4.19 × 10-4； 0.02/1.96/24.81 =4.11 ×10-4。因此,

7）供试品溶液色谱峰面积的相对不确定度 urel（A样）

供试品溶液的色谱峰面积采用双样两平行进行测定,测量次数较少,不确定度用极差法 μ=R/（C×S）计算,记录双样测量峰面积为 15626976,15672378,15596231,15510234,因此:

S1=（15626976＋15672378）/2=15649677,R1=45402

S2=（15596231＋15510234）/2=15553232,R2=85997

取 n=2时,极差系数 C=1.13,则相对不确定度:

2.2.4 相对不确定度分量汇总

通过以上量化分析,结果见表1。

2.2.5 合成不确定度 uc（Q）

表1 数据和相对不确定度

2.2.6 扩展不确定度 U

假定检验结果符合正态分布,在95%置信概率时,选择包含因子 k=2,则 U = k× uc（Q）=2×0.65% =1.3%。

2.2.7 测量不确定度报告

本试验注射用头孢曲松钠的含量为（94.7 ±1.3）%,k=2。

3 讨论

测量不确定度评定步骤分为:建立数学模型；找出所有影响测量不确定度的影响量；分析并计算各影响量的标准不确定度分量；列出不确定度分量汇总表；将各标准不确定度合成得到合成

标准不确定度；计算扩展不确定度；给出测量不确定度报告。

从上述对注射用头孢曲松钠含量测定不确定度的分析可以看出,供试品溶液色谱峰面积引起的不确定度分量对含量测定的影响最大,因此应定期对实验仪器进行检定和维护,保持稳定的状态,加强试验过程的控制及标准操作规程训练,以减少随机变化和人为因素对试验结果的影响。通过含量测定不确定度的影响因素分析,对于降低不确定度、提高检测结果的准确性具有一定的指导意义。

参考文献:

[1]JJF1059-1999,测量不确定度评定与表示[S].

[2]姜连阁,刘永成.白政忠.HPLC法含量测定不确定度分析及实例[J].药物分析杂志,2007,27（11）:1804.

[3]中国实验室国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京:中国计量出版社,2002:26.