广谱抗生素对大鼠肠道菌群多样性影响的16SrDNA基因测序研究

姚增武，仲蓓，王东升，曹守根，王松，周岩冰

（1 青岛大学医学院附属医院普外科，山东 青岛 266003； 2 青岛大学医学院附属医院高压氧科； 3 淄博市淄川区人民医院）

人类胃肠道存在大约1014个细菌，种类超过了1 000种。肠道细菌在营养吸收及代谢、维生素的产生、病原体的抵抗以及免疫系统的形成和维持等生理功能上发挥重要的作用。因肠道细菌的多样性和功能的丰富性，有人甚至将肠道细菌比作人体的一个“器官”［1－3］。研究表明，抗生素对于人类肠道菌群的平衡有重要的影响［4］。但上述研究通常采用的是细菌培养基的方法，这种方法只能确定20%～40%的肠道细菌的种类，有很大的局限性。近年来，16SrDNA基因高通量测序方法的发展使得我们可以检测到绝大多数的肠道细菌［5］。本研究通过采用16SrDNA基因测序这种更准确的技术，旨在明确广谱抗生素对大鼠肠道菌群多样性的影响。?

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性 Wistar大鼠（山东鲁抗医药股份有限公司提供）24只，8周龄，体质量（250±10）g。实验动物饲养于我院动物实验室，普通颗粒饲料喂养，自由进食、饮水，于（23±2）℃和相对湿度为（50±5）%的无特殊病原体环境下饲养1周以适应环境。

1.1.2 试剂及药物 注射用头孢唑林钠（武汉大华伟业医药化工有限公司）；粪便基因组DNA快速提取试剂盒及DNA Marker（北京百泰克生物技术有限公司）；Premix Taq Version 2.0（Takara生物技术有限公司）。电泳缓冲液的配制：将Tris 242g、Na2EDTA·2H2O 37.2g，置于1L烧杯中，向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加入57.1mL的乙酸，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至1L后，室温下保存。琼脂糖溶液的配制：稀释100mL的5×TBE溶液至500mL，取100mL溶解3g琼脂糖，煮沸，混匀直至没有气泡，冷却至60℃时加入10g／L EB 5μL，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，室温放置45min。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组及处理 将 Wistar大鼠24只随机分为一次应用抗生素组（A组）、多次应用抗生素组（B组）和对照组（C组），每组均为8只。A组：第一天按100mg／kg剂量腹腔注射头孢唑林钠，第2、3天分别用等量的生理盐水腹腔注射一次；B组：按100mg／kg剂量腹腔注射头孢唑林钠，并且连续用药3d；C组：腹腔注射等量生理盐水，持续3d。

1.2.2 粪便标本的收集及保存 收集3组大鼠用药前1d和用药结束后第1次粪便（大于2g）于无菌容器中，－80℃保存。

1.2.3 粪便标本DNA的提取 粪便标本解冻以后，按照粪便基因组DNA快速提取试剂盒的操作手册逐步操作，提取细菌DNA。

1.2.4 细菌DNA的扩增 进行细菌16SrDNA V3可变区 PCR 扩增，引物选择338F／533R（5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′／5′ TTACCGCGGCTGCTGGCAC3′，深圳华大基因科技公司合成），试剂选择Premix Taq。PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃45s，72℃1 min，共20个循环；最后72℃延伸10min。采用Qubit Fluorometer及琼脂糖凝胶电泳定量检测样本质量，选择DNA浓度均大于50mg／L、总量大于3ng的24份样品进行16SrDNA基因高通量测序。

1.2.5 细菌16SrDNA测序分析 用16SrDNA的高可变区Illumina测序技术，对样品的16SrDNA V3区PCR产物进行测序，得到原始的数据和reads。将reads进行去除接头序列、低复杂度序列和低质量序列的处理。将含有上述序列的reads去掉后，得到每个样品的Clean Data。对于这些reads进行Overlap拼接，形成目标序列Tag。对Tag序列进行去冗余处理，挑选出Unique Tag序列。将Unique Tag序列按照丰度从高到低排序，然后按照0.02的差异（或98%的相似度）进行预聚类。预聚类后的Tags在0.03距离下（或97%的相似度）计算OTU数量，并采用众数原则对每个OTU进行物种注释，即首先统计该OTU中所有Tags的物种注释信息，如果66%的Tags都支持同一个物种分类单元，那么该物种分类就作为该OTU的物种分类信息。

1.2.6 肠道细菌多样性指数 根据每个样品中的OTU总数和每个OTU的相对丰度进行样品多样性指数的计算。Chao1和ACE指数是根据所测得OTU的数量来预测样品中微生物种类，其值越大，物种越丰富；Shannon和Simpson指数是基于样品的所有OTU丰度和均匀度及其注释物种信息，反映肠道菌群中所有物种的种类数及每个物种个体数占群落中总个体数比例，Shannon指数越大，Simpson指数越接近于0，表示样品中物种越丰富。

1.3 统计学处理

16SrDNA的基因测序分析采用Mothur V.1.11.0软件进行处理。计量资料以表示，数据间比较采用配对t检验和成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

对24份粪便样本DNA的16SrDNA V3区进行Illumina测序，得到约8.24Gb的原始数据。每个样本产出约33 000条reads，经过去除接头序列、低复杂度序列和低质量序列后，每个样本大约得到了80%的Clean Data。将这些reads进行Overlap拼接，得到的Tag序列，其长度分布在134、152和157bp左右，这与多数细菌V3区域的长度是一致的。所有样本预聚类后的Tags在0.03距离下得出OTU数量为1 859±208。24份样品均有多于80%的Tag序列能够注释到“目”的水平，而能够注释到“科”的水平的Tag序列低于60%，选择“目”作为24份样品的最佳分类水平。

2.1 各组肠道菌群Chao1、ACE指数变化

A、B组肠道菌群OTU的Chao1、ACE指数用药后较用药前降低，差异均有统计学意义（t＝5.3～12.7，P＜0.05）；C 组用药后肠道菌群 OTU 的Chao1、ACE指数变化无显著性（P＞0.05）。B组Chao1、ACE指数降低较 A 组更明显（t＝5.6、5.3，P＜0.05）。见表1、2。

2.2 各组肠道菌群Shannon、Simpson指数变化

A、B组大鼠肠道菌群Shannon指数用药后较用药前显著降低（t＝7.6、12.4，P＜0.05），C组用药后肠道菌群Shannon指数变化无统计学意义（P＞0.05）；B组的Shannon指数降低较A组更明显（t＝－4.1，P＜0.05）。见表3。A、B组肠道菌群Simpson指数用药后较用药前均显著升高（t＝4.4、9.5，P＜0.05），C组用药后肠道菌群Simpson指数变化无统计学意义（P＞0.05）；B组的Simpson指数升高较A组更明显（t＝5.7，P＜0.05）。见表4。

表1 各组OTU的Chao1指数用药前后的变化（）

表1 各组OTU的Chao1指数用药前后的变化（）

与用药前比较，＊t＝5.3、12.7，P＜0.05。

组别 用药前 用药后 差值A组 5 303.9±292.7 5 103.0±276.9＊ 200.9± 93.5 B组 5 169.8±265.4 4 670.1±239.5＊ 499.6±119.8 C组5 264.1±363.1 5 240.0±368.3 24.1± 95.1

表2 各组OTU的ACE指数用药前后的变化（）

表2 各组OTU的ACE指数用药前后的变化（）

与用药前比较，＊t＝6.2、11.2，P＜0.05。

组别 用药前 用药后 差值A组 10 108.9±541.3 9 725.8±468.0＊ 383.1±175.3 B组 10 295.9±458.6 9 360.5±467.9＊ 935.4±236.8 C组10 597.9±761.0 10 539.4±755.3 58.5±156.7

表3 各组OTU的Shannon指数用药前后的变化（）

表3 各组OTU的Shannon指数用药前后的变化（）

与用药前比较，＊t＝7.6、12.4，P＜0.05。

组别 用药前 用药后 差值A组 4.323±0.274 2.805±0.585＊ 1.519±0.563 B组 4.101±0.302 1.370±0.685＊ 2.731±0.623 C组4.245±0.280 4.203±0.318 0.041±0.172

表4 各组OTU的Simpson指数用药前后的变化（）

表4 各组OTU的Simpson指数用药前后的变化（）

与用药前比较，＊t＝4.4、9.5，P＜0.05。

组别 用药前 用药后 差值A组 0.087±0.012 0.130±0.033＊ －0.043±0.027 B组 0.092±0.012 0.237±0.049＊ －0.146±0.044 C组0.088±0.011 0.091±0.013 －0.003±0.085

3 讨 论

本研究采用16SrDNA的基因测序方法来观察广谱抗生素用药时间长短对大鼠肠道菌群多样性的破坏程度，高通量测序技术通过对肠道细菌的16S rDNA中高可变区序列的测序来确定肠道细菌种类和数目相对值，具有高准确度、高通量、高灵敏度、低成本等优势。采用的广谱抗生素为临床上常用的头孢唑啉，其抗菌谱广，对革兰阳性球菌有良好的抗菌活性；同时模拟了胃肠外科手术中抗生素常用的剂量及用药时间。结果显示，即使一次应用抗生素也会造成大鼠肠道菌群多样性的破坏，其特征性指数Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，而且抗生素的应用时间越长，肠道菌群多样性的降低越显著，而这些变化在对照组中却不明显。

NOVELLI等［6］研究结果显示，支气管炎病人分别应用头孢克肟（8例）和头孢呋辛（8例）治疗10d，两组病人肠道细菌的多样性显著下降，肠细菌和梭菌属减少较为明显，同时伴有肠球菌的增加；头孢克肟组有4例病人的粪便培养出沙门菌，而头孢呋辛组有2例病人的粪便培养出难辨梭状芽胞杆菌。BRISMAR等［7］研究结果显示，14例健康志愿者口服头孢布坦10d，用药前后其肠道菌群的多样性发生了显著下降，大肠杆菌和厌氧球菌数量明显下降，而肠球菌数量明显增加，其中6例志愿者在用药后的粪便中发现了难辨梭状芽胞杆菌。上述结果与本研究采用高通量测序方法所得的结果基本一致。抗生素的应用可造成肠道菌群紊乱，其紊乱的程度与抗生素种类的选择、用药时间的长短以及个体的敏感性等因素有关。抗生素过度应用极易造成肠道菌群多样性的破坏，导致很多罕见菌或机会性感染细菌的增殖，从而导致抗生素相关性肠炎，最为典型的是难辨梭状芽胞杆菌相关性肠炎，严重者可导致死亡［8－10］。

国际上各个国家都存在不同程度的抗生素应用不合理的问题，这在我国表现得尤为突出。黎沾良等［11］对我国118所三级综合性医院的围手术期抗菌药物使用状况的调查结果显示，不合理、不规范的现象十分突出，如抗菌药物的使用率过高、抗菌药物选择不合理、联合用药及用药时机不规范、用药时间过长、用法用量不规范等。虽然小剂量短时间的抗生素应用可能未引起相关的症状（如腹泻、发热等），但是其肠道菌群多样性可能已经发生了变化，并且导致一些潜在致病菌的增殖，这都可能形成抗生素相关肠炎的潜在风险。临床工作中，抗生素相关性肠炎的发生在胃肠道外科最为常见，这与围手术期抗生素的应用、手术对于胃肠道黏膜屏障等的直接损伤、术前灌肠及禁食等相关，而围手术期抗生素的应用则起到了主要的作用［12］。抗生素的使用是一把双刃剑，最佳的效果是既能保证其抗感染的功效又能将其对肠道微生态平衡的破坏降至最低。因此在临床工作中，应严格把握抗生素适应证及用法、用量，合理使用抗生素，避免过度使用。人体肠道细菌有一定的弹性，在抗生素使用后可不同程度地恢复［13］。本研究尚未观察大鼠肠道菌群的恢复情况，将来有待于对大鼠肠道细菌的弹性及恢复性做进一步的研究。

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